乳腺肿块患者血清和肿块组织中B细胞淋巴瘤因子3蛋白的表达及临床意义

王妍妍，赵永新，王建强，康丽霞，王 辉

(1.新乡医学院第三附属医院检验科，河南 新乡 453003；2.新乡医学院第三附属医院病理科，河南 新乡 453003；3.新乡医学院医学检验学院，河南 新乡 453003)

国际癌症研究机构2020年全球癌症负担数据显示，乳腺癌已取代肺癌成为全球第一大癌症，新发病例高达226万例，其中中国新发乳腺癌为42万例[1]。乳腺癌早期无特异性症状，很多患者确诊时已为中晚期，失去了最佳的手术时机，预后不良，因此，乳腺癌的早期诊断极为重要[2]。癌症的发生、发展与原癌基因和抑癌基因的异常激活密切相关。人类B细胞淋巴瘤因子3(B-cell lymphoma factor 3,Bcl-3)基因位于19q13染色体，是一种原癌基因，主要参与调控细胞的增殖与凋亡，其异常表达最早见于慢性B细胞淋巴细胞白血病[3]。随着研究的不断深入，Bcl-3被发现在多种实体肿瘤组织中过度表达，促进肿瘤细胞的增殖[4-6]。有研究发现，Bcl-3高表达可以抑制乳腺癌细胞凋亡，从而参与乳腺癌的发生、发展[7-8]。血清为临床容易获得的标本，Bcl-3蛋白在乳腺癌患者血清中的表达情况目前尚不明确。本研究旨在探讨Bcl-3蛋白在乳腺肿块患者血清和肿块组织中的表达情况，以期为乳腺癌的临床诊断寻求新的、快捷的标志物提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年12月至2019年3月新乡医学院第三附属医院收治的56例乳腺肿块患者为研究对象，患者年龄23～63岁，中位年龄43岁；患者术前均未接受化学治疗、放射治疗，且临床病理资料完整；所有乳腺肿块组织行病理学检查，根据病理学检查结果将患者分为非肿瘤组(包括乳腺炎、乳腺导管扩张症、乳腺增生症、脂膜炎、乳腺腺病)12例、良性肿瘤组(包括乳腺腺病伴导管内乳头状瘤、纤维腺瘤、纤维脂肪瘤、乳腺腺病伴纤维腺瘤、乳腺导管内乳头状瘤)24例、恶性肿瘤组(包括乳腺浸润性小叶癌、乳腺浸润性导管癌、非特殊型浸润性癌)20例；非肿瘤组、良性肿瘤组和恶性肿瘤组患者的年龄分别为29～50(40.6±28.09)、24～50(42.14±8.54)、32～60(48.20±7.38)岁，3组患者的年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器Bcl-3酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，Bcl-3抗体购自美国Proteintech公司，抗原修复缓冲液购自河南赛诺特生物技术有限公司，兔链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-perosidase,SP)法检测系统试剂盒、二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，苏木精购自深圳康泰生物制品股份有限公司；酶标仪购自安图生物工程股份有限公司，烤片机、脱蜡机购自上海徕卡仪器有限公司。

1.3 免疫组织化学SP法检测肿块组织中Bcl-3蛋白表达取手术切除的肿块组织，40 g·L-1多聚甲醛固定，修块、洗涤、脱水、透明，浸蜡、包埋、切片，常规脱蜡水化；浸泡于自来水、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solation,PBS)各3次，每次3 min；100 ℃抗原修复5 min；滴加内源性过氧化物酶阻断剂，25 ℃孵育20 min；PBS冲洗3次，每次3 min；滴加山羊血清封闭液，25 ℃孵育20 min；滴加Bcl-3抗体，以PBS代替一抗作为阴性对照，4 ℃冰箱孵育24 h；PBS冲洗3次，每次1 min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，25 ℃孵育20 min；PBS冲洗3次，每次1 min；DAB显色，苏木精复染，自来水返蓝，透明，封片；光学显微镜下观察。Bcl-3蛋白阳性表达定位于细胞核，呈淡黄色、黄色、棕黄色颗粒。结果判定：每张切片随机选取10个高倍(×400)视野，计算10个视野中阳性细胞百分率，阳性细胞百分率≤5%计为0分，5%<阳性细胞百分率≤25%计为1分，25%<阳性细胞百分率≤50%计为 2分，50%<阳性细胞百分率≤75%计为3分，阳性细胞百分率>75% 计为4分。依据细胞核染色强度：无染色计为0分；淡黄色计为1分；黄色计为2分；棕黄色计为3分。以阳性细胞百分率评分与染色强度评分之和作为最终判定标准：0分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)；将阴性(-)和弱阳性(+)定义为阴性，阳性(++)和强阳性(+++)定义为阳性。阳性表达率=阳性例数/总例数×100%。

1.4 ELISA法检测血清中Bcl-3蛋白水平手术前抽取患者晨起空腹肘正中静脉血3 mL，2 500 r·min-1离心5 min，取上层血清，置于-80 ℃冰箱保存，测定时提前解冻恢复至室温。设空白孔、标准孔、待测样品孔，在已包被板上分别准确滴加血清标本50 μL，空白孔除外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃温育30 min；洗涤5次，拍干；每孔加入显色剂A、B各50 μL，37 ℃避光显色15 min；每孔加终止液50 μL，终止反应。15 min内应用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的吸光度值，以标准品浓度作纵坐标，对应的吸光度值为横坐标，绘制出标准品线性回归曲线，根据曲线方程计算各样本的Bcl-3蛋白水平。

2 结果

2.1 3组患者乳腺肿块组织中Bcl-3蛋白的表达结果见图1。非肿瘤组、良性肿瘤组、恶性肿瘤组患者乳腺肿块组织中Bcl-3蛋白阳性表达率分别为16.67%(2/12)、54.17%(13/24)和85.00%(17/20)；恶性肿瘤组患者乳腺肿块组织中Bcl-3蛋白阳性表达率显著高于良性肿瘤组和非肿瘤组，差异有统计学意义(χ2=4.781、14.521，P< 0.05)；良性肿瘤组患者乳腺肿块组织中Bcl-3蛋白阳性表达率显著高于非肿瘤组，差异有统计学意义(χ2=4.629，P<0.05)。

A：非肿瘤组；B：良性肿瘤组；C：恶性肿瘤组。

2.2 3组患者血清中Bcl-3蛋白水平比较非肿瘤组、良性肿瘤组、恶性肿瘤组患者血清中Bcl-3蛋白水平分别为(48.10±23.03)、(34.75±17.93)、(22.50±18.29)μg·L-1；恶性肿瘤组患者血清中Bcl-3蛋白水平显著低于良性肿瘤组和非肿瘤组，差异有统计学意义(t=2.186、3.367，P<0.05)；良性肿瘤组患者血清中Bcl-3蛋白水平显著低于非肿瘤组，差异有统计学意义(t=1.865，P<0.05)。

3 讨论

乳腺癌是女性临床常见的恶性肿瘤之一，近年来，其发病呈现年轻化趋势。乳腺癌早期无明显症状，易延误治疗时机，降低患者的生活质量[9]。目前，乳腺癌诊断的金标准是活体组织检查，但其创伤性大，不易早期检测，存在一定的局限性[10]。液体活检由于无创性和低成本，正逐渐成为乳腺癌新的辅助诊断方法[11]。血液采集具有简单、方便、非侵入性等优点，血液中乳腺癌生物学标志物得到了广泛的研究。乳腺癌易感基因、DNA甲基化、微RNA和循环肿瘤细胞等均可以提高乳腺癌的早期诊断率[12]。Bcl-3属于原癌基因，在多种实体瘤中发挥作用，本研究旨在通过检测Bcl-3蛋白在乳腺肿块患者的乳腺肿块组织及血清中的表达，探讨Bcl-3蛋白成为乳腺癌生物学标志物的可能性。

细胞凋亡与肿瘤形成密切相关，在异常细胞发展为癌细胞的过程中必须绕过凋亡。因此，抗凋亡是肿瘤细胞的一个重要特征[13]。Bcl-3通过增强正常细胞和癌细胞中Hdm2的转录来下调p53活性，从而抑制DNA损伤诱导的凋亡[14]。Bcl-3的抗凋亡功能提示其过表达可为癌细胞提供生存优势，从而为Bcl-3的原癌发生功能提供可信的分子机制。CHOI等[7]研究发现，Bcl-3高表达可使促凋亡基因表达下调，乳腺癌细胞凋亡受到抑制。袁建良等[8]研究显示，Bcl-3在癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织，Bcl-3表达上调可能参与了乳腺癌的发生和发展。本研究结果显示，恶性肿瘤组患者乳腺肿块组织中Bcl-3蛋白阳性表达率显著高于良性肿瘤组和非肿瘤组，良性肿瘤组患者乳腺肿块组织中Bcl-3蛋白阳性表达率显著高于非肿瘤组，提示Bcl-3蛋白与乳腺癌的发生和发展有关。

为了探讨Bcl-3蛋白是否在乳腺癌患者血清中异常释放，本研究采用ELISA法分析了各组患者血清中Bcl-3蛋白水平，结果显示，恶性肿瘤组患者血清中Bcl-3蛋白水平显著低于良性肿瘤组和非肿瘤组，良性肿瘤组患者血清中Bcl-3蛋白水平显著低于非肿瘤组，提示肿块组织恶性程度越高，血清中Bcl-3蛋白水平越低，这与Bcl-3蛋白在乳腺肿块组织中的表达趋势相反。CHEN等[15]研究发现，通过细胞死亡释放的炎症因子可诱导Bcl-3的产生，并通过外泌体颗粒自主释放到血清中。作者认为，非肿瘤组患者的乳腺肿块多处于炎症阶段，引起大量细胞坏死，释放大量炎症因子，炎症因子诱导Bcl-3产生，并分泌到血清中，导致非肿瘤组血清中Bcl-3蛋白水平升高；肿瘤组患者一般无明显的全身性炎症反应，血清中Bcl-3蛋白水平较低；但这一现象仍需大样本研究证实。

综上所述，乳腺癌组织中Bcl-3蛋白表达上调，乳腺癌患者血清中Bcl-3蛋白水平降低，检测Bcl-3蛋白可能为乳腺癌的诊断提供参考。