原发性肝癌组织中微RNA-543表达与微血管密度的相关性

陈文换，杨峰燕，张艳华，白志超，高建芝

(1.涿州市医院病理科，河北 涿州 072750；2.涿州市医院肿瘤科，河北 涿州 072750；3.涿州市医院神经内科，河北 涿州 072750)

原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)是发病率较高的恶性肿瘤之一，其转移率、复发率及致死率较高，近年来，PLC发病率呈上升趋势，严重影响患者的身心健康和生命质量[1-2]。研究显示，微RNA(microRNA,miR)与PLC的发生和发展密切相关，miR-543可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[3-4]。有研究显示，肿瘤的生长和浸润需要新生血管不断提供充足的营养物质，微血管密度(microvessel density,MVD)可反映肿瘤的血管生成程度，在肿瘤生物学行为演进中起非常重要的作用[5-6]。本研究旨在探讨PLC组织中miR-543表达与MVD的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2016年6月至2020年6月涿州市医院收治的100例PLC患者作为观察组，所有患者经影像学及病理学检查确诊为PLC，术前未进行放射治疗、化学治疗及动脉栓塞治疗，且无其他严重基础疾病及肿瘤。另选择同期因外伤行部分肝切除的70例患者作为对照组，所有患者为外伤性肝破裂，并伴有失血性休克，且未合并肝癌及其他肿瘤。观察组：男87例，女13例；年龄29～81(62.54±9.36)岁，体质量指数25～42(29.26±4.23)kg·m-2；单发肿瘤56例，多发肿瘤44例；合并肝硬化64例，未合并肝硬化36例；肿瘤直径<5 cm者59例，≥5 cm者41例；TNM临床分期：Ⅰ、Ⅱ期38例，Ⅲ、Ⅳ期62例。对照组：男49例，女21例；年龄23～76(60.49±8.27)岁，体质量指数22～39(28.14±4.04)kg·m-2。2组患者的性别、年龄、体质量指数比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，均有患者及家属签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器TRIzol试剂盒购自天根生物科技(北京)有限公司，实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司，CD34单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记兔鼠通用二抗试剂、抗原修复仪及LINK48自动免疫组织化学染色仪购于丹麦Dako公司。

1.3 qRT-PCR法检测PLC组织和正常肝组织中miR-543的表达按照TRIzol试剂盒说明书裂解、提取PLC和正常肝组织中总RNA，按照qRT-PCR试剂盒说明书反转录合成cDNA。miR-543上游引物序列为5′-GGGGAAACATTCGCGGTGCA-3′，下游引物序列为5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′。以U6为内参，U6的上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列为5′-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3′。反应条件：预变性95 ℃、5 min；变性95 ℃、25 s；退火60 ℃、50 s；延伸72 ℃、40 s，共40个循环。实验重复3次，取均值。采取2-ΔΔCt法计算miR-543的相对表达量。

1.4 免疫组织化学染色法检测PLC组织和正常肝组织中MVD石蜡组织连续切片(厚约4 μm)，65 ℃烤箱烤1 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，抗原修复1.5 h，滴加阻断剂、一抗CD34(滴度1100)、HRP二抗(滴度12 000)，二氨基联苯胺显色，苏木精复染、分化、蓝化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。以抗CD34单克隆抗体标记的血管内皮细胞计数MVD，按Weidner校正方法计数，先低倍镜(40倍)下寻找癌组织中CD34阳性微血管最密集区域，再于高倍镜(200倍)下选取5个视野，计数每个视野下微血管数量，取均值。

2 结果

2.1 PLC组织和正常肝组织中miR-543相对表达量比较PLC组织和正常肝组织中miR-543相对表达量分别为3.231±0.312、1.021±0.052，PLC组织中miR-543相对表达量显著高于正常肝组织，差异有统计学意义(t=4.216，P<0.05)。

2.2 PLC组织和正常肝组织中MVD比较结果见图1和图2。CD34抗体表达于血管内皮细胞的细胞质中，呈棕黄色颗粒弥漫性分布。PLC组织和正常肝组织中MVD分别为44.79±8.54、9.68±3.27，PLC组织中MVD显著高于正常肝组织，差异有统计学意义(t=3.175，P<0.05)。

图1 PLC组织中CD34蛋白的表达(免疫组织化学染色，×200)Fig.1 Expression of CD34 protein in PLC tissues (immunohistochemical staining,×200)

图2 正常肝组织中CD34蛋白的表达(免疫组织化学染色，×200)Fig.2 Expression of CD34 protein in normal liver tissues (immunohistochemical staining,×200)

2.3 miR-543表达和MVD与PLC病理特征的关系结果见表1。miR-543表达和MVD与肿瘤直径、肿瘤分期有相关性(P<0.05)，而与肿瘤数目、是否合并肝硬化无相关性(P>0.05)。

表1 miR-543表达和MVD与PLC病理特征的关系Tab.1 Relationship between miR-543 expression,MVD and pathological features of PLC

2.4 PLC组织中miR-543表达与MVD的相关性PLC组织中miR-543表达与MVD呈正相关(r=0.601，P<0.05)。

3 讨论

PLC常见的组织学类型有肝细胞癌和肝内胆管细胞癌，大体上可分为孤立型、多结节型、弥漫型和巨块型，多数晚期患者可见门静脉癌栓形成。PLC的易感因素有乙肝病毒、乙醇及黄曲霉毒素等，在我国多由肝炎及肝硬化发展而来，目前临床上多依赖病史、影像学及病理学检查等进行诊断[7-8]。PLC患者的预后较差，5 a存活率较低，早期发现并及时给予治疗可提高患者生存率。目前，肝癌最有效的治疗方法为手术完整切除，无法手术或复发性肿瘤可采用肝动脉栓塞等治疗方法。肝癌的发生、发展涉及多种向肿瘤细胞传达增殖和细胞生存表型的遗传学改变，包括染色体扩增、杂合性缺失及突变等，可为临床靶向治疗提供依据。

miR属于非编码单链RNA，广泛存在于真核生物，参与基因表达调控及生物体发育时序等各个阶段，且对恶性肿瘤具有双向调节作用[9-10]。有文献指出，miR-122、miR-26a等表达下调及miR-115、miR-221等表达上调与肝癌的发生和发展密切相关[11]。研究显示，miR-135a、miR-106b、miR-500a为肝细胞癌的致癌基因，miR-199a、miR-125、miR-26a为肝细胞癌的抑癌基因[12]；有研究发现，肝细胞癌组织中miR-543表达水平显著高于癌旁组织，表明miR-543作为一种致癌基因参与细胞癌的生长和转移[13]。本研究结果显示，miR-543在PLC组织中的表达显著高于正常肝组织，提示miR-543可能与PLC的发生、发展密切相关；同时，miR-543表达和MVD与肿瘤直径、肿瘤分期有相关性，其在直径≥5 cm及Ⅲ、Ⅳ期肿瘤组织中表达显著升高，提示miR-543可能与肿瘤的增殖、侵袭有关。

肝脏为富血供器官，肝癌的肝内、外转移主要是通过血液，癌细胞可通过门静脉系统在肝内播散或转移至肺，也可经肝静脉达下腔静脉及右心房，少数可通过血行广泛播散，发生肾上腺和骨转移。血源性转移多见于巨块型和弥漫型肝细胞癌，发生转移者临床分期晚、预后差、生存率低，需选择放射治疗、化学治疗、免疫治疗等综合性治疗方案，因此，通过减少微血管形成而阻止肿瘤转移成为医学研究的一个重要方向[14-15]。肿瘤的生长及侵袭等生物学行为依赖于间质丰富的血供系统、新生血管形成及血液中丰富的营养物质和分泌因子，癌组织中微血管形成情况可通过MVD得到反映[16-17]。有研究显示，肝癌组织中MVD与组织分化程度、肿瘤大小、门静脉癌栓及甲胎蛋白水平显著相关[18]。本研究结果显示，PLC组织中MVD显著高于正常肝组织，PLC组织中MVD与肿瘤直径、肿瘤分期有相关性，其在直径≥5 cm及Ⅲ、Ⅳ期肿瘤组织中水平升高，且PLC组织中miR-543表达与MVD呈正相关，表明MVD高可能预示肿瘤生长速度快、转移率高及预后不佳。

综上所述，miR-543在PLC组织中表达上调，且其表达与肿瘤组织中MVD呈正相关，提示miR-543表达上调和肿瘤组织中MVD增加可能与PLC的进展有关。本研究从基因层面和脉管系统为阐明PLC的发病机制提供了必要的前期研究基础，为PLC的早期诊断和靶向治疗提供了一定的实验依据。