食管鳞状细胞癌组织中plexin-A4和程序性死亡蛋白-1表达与预后的关系

王 淼,曹克鑫,陈志军,张景航,甘绍印,常勇生,李文华,王忠民

(1.新乡医学院第一附属医院胸外科一病区,河南 卫辉 453100；2.河南省神经修复重点实验室,河南 卫辉 453100；3.新乡医学院第一附属医院病理科,河南 卫辉 453100；4.新乡医学院第一附属医院消化科一病区,河南 卫辉 453100)

食管癌的发病率在世界范围内逐年上升，有半数以上的食管癌患者位于中国[1]。其中食管鳞状细胞癌在食管癌中最为常见。食管鳞状细胞癌是来源于食管黏膜上皮基底层的恶性肿瘤，病情进展快，仅以手术方式难以将其根治。随着医疗科技水平的进步，免疫治疗成为食管鳞状细胞癌的治疗方法之一。其中程序性死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)可作为免疫疗法的代表，PD-1与程序性死亡蛋白配体-1(programmed cell death protein-ligand 1,PD-L1)结合可传递免疫反应的抑制信号，促使肿瘤细胞逃过免疫细胞的识别与杀伤，促进肿瘤的发展[2]。神经丛素(plexins)家族已成为近些年来免疫治疗的重要因子，被证实可在多种肿瘤组织中呈高表达[3]，plexins-A4蛋白属于该家族。脑信号蛋白(Sema)是能够完善免疫系统和促进神经系统发育的一类信号素。plexins是Sema家族重要的特异性跨膜受体，二者结合后可促进肿瘤细胞的增殖分化、黏附及迁移等过程[3]。目前，国内外关于plexins-A4、PD-1在食管鳞状细胞癌中的表达相关报道较少。本研究旨在探讨PD-1和 plexin-A4 在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其对患者预后的影响，以期对食管鳞状细胞癌的免疫治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2014年3月至2014年12月新乡医学院第一附属医院收治的食管鳞状细胞癌患者80例为研究对象，患者均经组织病理学确诊为食管鳞状细胞癌并首次进行食管鳞状细胞癌切除术，术前患者均无放射治疗、化学治疗史，且无其他部位肿瘤。80例患者中，男52例，女28例；年龄47～73(59.6±9.3)岁，其中>60岁者46例，≤60岁者34例；病理分型：髓质型43例，溃疡型27例，蕈伞型5例，缩窄型5例；吸烟44例，不吸烟36例；饮酒41例，不饮酒39例；组织分化程度：高分化38例，中分化32例，低分化10例；浸润程度：T1期8例，T2期25例，T3期47例；有淋巴结转移31例，无淋巴结转移49例。取所有患者术中切除的食管鳞状细胞癌组织和距癌组织5 cm以上的正常食管鳞状上皮组织(癌旁组织)，将一部分标本用甲醛固定后石蜡包埋保存，另一部分冻存于-80 ℃冰箱待用。

1.2 试剂与仪器plexin-A4抗体和PD-1抗体购自英国Abcam公司，反转录试剂盒、二氨基联苯胺(diaminobenzidline,DAB)显色试剂盒、TRIzol试剂购自日本TaKaRa公司，兔抗人抗体试剂、焦炭酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、山羊血清购自北京中杉金桥生物科技公司，SYBR mix购自北京鼎国生物科技公司；紫外分光光度计、聚合酶链反应仪、光学显微镜购自美国ABI公司；plexin-A4、PD-1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应法检测食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中plexin-A4和PD-1 mRNA 表达将低温冻存的食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织分别在液氮预冷的研钵中研磨至粉末状。加入1 mL TRIzol试剂，混匀后静置5 min，12 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液置入新的离心管中，加入0.5 mL异丙醇，在室温下静置10 min,12 000 r·min-1离心10 min，加入1 mL乙醇,7 500 r·min-1离心5 min，取沉淀弃上清液。将沉淀后的总RNA室温干燥后溶解于20 μL DEPC水中，使用紫外分光光度计检测RNA浓度。使用反转录试剂盒将RNA反转录为 cDNA，以GAPDH为内参进行实时荧光定量聚合酶链反应。PD-1上游引物序列为5′-ATCTCACCGCTCGTTTCCT-3′，下游引物序列为5′-CACTGCAAACCTCGGTGATG-3′；plexin-A4上游引物序列为5′-TCTCAGTACAACGTGCTG-3′， 下游引物序列为5′-TAGCACTGGATCTGATTGC-3′；GAPDH上游引物序列为5′-GTACGACTCACTATAGGGA-3′， 下游引物序列为5′-AACAGCGACACCCACTCCTCCA-3′。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，共35个循环。反应体系20 μL：2×SYBR mix 10 μL，cDNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL，灭菌水6 μL 。采用2-△△Ct法计算目的基因plexin-A4和PD-1 mRNA相对表达量。

1.4 免疫组织化学法检测食管鳞状细胞癌组织中plexin-A4和PD-1蛋白表达取所有患者食管鳞状细胞癌组织制备4 μm切片，经脱蜡、梯度乙醇水化、抗原修复等处理后，加入山羊血清室温封闭30 min，磷酸盐缓冲溶液冲洗。加入一抗plexin-A4(滴度150)与PD-1(滴度150)，4 ℃孵育过夜。磷酸盐缓冲溶液浸洗切片并甩干，滴加二抗兔抗人抗体，室温下孵育1 h。最后将组织切片用DAB和苏木精染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，中性树胶封片，光学显微镜下观察。阳性细胞(即plexin-A4和PD-1蛋白表达细胞)判定标准：细胞被染成棕黄色。选取同一张切片上5个视野(200×)进行拍照，每个视野中计数100个食管鳞状细胞癌细胞，并计数阳性细胞数，计数后取均值。阳性细胞数占100个癌细胞总数的比值≥50%为表达阳性。plexin-A4或PD-1蛋白阳性表达率=阳性表达例数/总例数×100%。

1.5 随访通过查阅病历、电话等对80例患者进行随访，记录患者生存时间，随访截止日期为2019年6月。

2 结果

2.1 食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中plexin-A4和PD-1 mRNA 相对表达量比较食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中plexin-A4 mRNA相对表达量分别为0.95±0.62、0.36±0.26，食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中PD-1 mRNA相对表达量分别为1.47±0.99、0.48±0.32。食管鳞状细胞癌组织中plexin-A4和PD-1 mRNA相对表达量均显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 plexin-A4和PD-1在食管鳞状细胞癌组织中的表达结果见图1。plexin-A4主要表达于细胞质，呈棕黄色颗粒；PD-1表达于细胞质和细胞膜，呈棕黄色颗粒。plexin-A4和PD-1蛋白在食管鳞状细胞癌组织中的阳性表达率分别为48.75%(39/80)和75.00%(60/80)。

A:plexin-A4蛋白表达；B：PD-1蛋白表达。

2.3 食管鳞状细胞癌组织中plexin-A4、PD-1蛋白表达与临床特征之间的关系结果见表2。plexin-A4蛋白表达与肿瘤的浸润程度显著相关(P<0.05)，与患者的性别、年龄、吸烟、饮酒、病理分型、分化程度、淋巴结转移无关(P>0.05)。PD-1蛋白表达与患者的年龄、肿瘤浸润程度、淋巴结转移显著相关(P<0.05)，与患者的性别、吸烟、饮酒、病理分型、分化程度无关(P>0.05)。

表1 PD-1和plexin-A4在食管鳞癌组织中表达的临床特征Tab.1 Clinical characteristics of PD-1 and plexin-A4 expression in esophageal squamous cell carcinoma

2.4 食管鳞状细胞癌组织中plexin-A4、PD-1蛋白表达水平与患者术后生存期的关系结果见图2、3。plexin-A4阳性及plexin-A4阴性表达患者的5 a生存率分别为33.33%(20/60)和50.00%(30/60),PD-1阳性及PD-1阴性表达患者的5 a生存率分别为26.67%(16/60)和71.67%(43/60)。plexin-A4和PD-1阴性表达患者的5 a生存率显著长于阳性表达患者，差异有统计学意义(χ2=1.461、11.673，P<0.05)。

图2 食管鳞状细胞癌组织中plexin-A4蛋白阳性表达与阴性表达患者生存曲线比较Fig.2 Survival curves of patients with positive and negative expression of plexin-A4 protein in esophageal squamous cell carcinoma tissues

图3 食管鳞状细胞癌组织中PD-1蛋白阳性表达与阴性表达患者生存曲线Fig.3 Survival curves of patients with positive and negative expression of PD-1 protein in esophageal squamous cell carcinoma tissues

2.5 食管鳞状细胞癌患者单因素和多因素生存分析结果见表2和表3。分化程度、淋巴结转移、PD-1表达水平为影响食管鳞状细胞癌患者的独立预后因素(P<0.05)。性别、年龄、病理分型、肿瘤浸润程度、plexin-A4表达水平与食管鳞状细胞癌患者生存期无显著相关性(P>0.05)。

表2 食管鳞状细胞癌患者临床病理特征及plexin-A4、PD-1表达的Cox单因素生存分析Tab.2 Cox univariate survival analysis of clinicopathological characteristics and plexin-A4 and PD-1 expression of patients with esophageal squamous cell carcinoma

表3 食管鳞状细胞癌患者临床病理特征及plexin-A4、PD-1表达的Cox多因素生存分析Tab.3 Cox multivariate survival analysis of clinicopathological characteristics and plexin-A4 and PD-1 expression of patients with esophageal squamous cell carcinoma

3 讨论

食管癌已成为消化道的常见恶性肿瘤。据统计，鳞状细胞癌在食管癌的病理分型中达90%以上[4]。食管鳞状细胞癌早期症状不典型，诊断较为困难，当患者出现吞咽困难等症状时多数已处于中晚期。目前，尽管治疗食管鳞状细胞癌有手术、化学治疗及放射治疗等多种方案，但临床疗效欠佳。随着食管鳞状细胞癌细胞的增殖、浸润和转移，手术治疗已难以延长患者的生命，术后5 a生存率仅为15%～25%[5]。目前，生物免疫疗法已成为新兴的治疗手段，其中以PD-1/PD-L1靶点的免疫疗法最为典型，该治疗方法通过阻断PD-1/PD-L1信号转导通路，恢复机体正常免疫应答，并激发以T细胞为主的免疫细胞的生物学功能，抑制恶性肿瘤的免疫逃逸机制，进而杀伤肿瘤细胞。国内外对PD-1/PD-L1通路的研究已获得显著性成果，PD-1被证实在鼻咽癌、黑色素瘤、肺癌等恶性肿瘤组织中的表达量较癌旁组织中均有明显升高[6-8]。plexins家族是连接细胞膜内外并产生生物学效应的类跨膜蛋白，其可作为信号素Semaphorins家族的重要受体，二者可结合形成复合体，参与肿瘤的增生、异型性突变与黏附等过程[9]。plexins受体包括plexin-A(1-4)、plexin-B(1-3)、plexin-C1、plexin-D1亚型[10]。本研究结果发现，食管鳞状细胞癌组织中plexin-A4和PD-1 mRNA相对表达量均显著高于癌旁组织，提示plexin-A4和PD-1可促进食管鳞状细胞癌的发生发展。

有研究表明，plexin-B1在胰腺癌组织中的阳性表达率为72.46%[11]，plexin-A1在人脑胶质瘤组织中的阳性表达率为51.16%[12];PD-1在非小细胞肺癌的阳性表达率为61.67%[13]，PD-1在食管癌组织、癌旁非典型增生组织、正常食管组织阳性表达率依次为51.2%、22.9%和6.7%[14]。本研究结果显示，plexin-A4和PD-1在食管鳞状细胞癌组织中的阳性表达率分别为48.75%(39/80)和75.00%(60/80)，提示PD-1较plexin-A4在肿瘤组织中可能有更高的阳性表达率。

本研究通过分析食管鳞状细胞癌组织中plexin-A4、PD-1蛋白表达与临床病理特征之间的关系发现，plexin-A4蛋白表达与肿瘤浸润程度显著相关，PD-1蛋白表达与年龄、浸润程度、淋巴结转移显著相关，提示plexin-A4和PD-1可能促进了食管鳞状细胞癌的血管生成，PD-1可能促进淋巴管生成，从而使食管鳞状细胞发生癌细胞浸润和转移；并且随着食管鳞状细胞癌患者年龄的增长及淋巴结扩散转移，PD-1的表达有所增强；此外，PD-1在病理特征上较plexin-A4有更多的相关影响因素。本研究表明，plexin-A4在病理特征方面仅与肿瘤浸润程度有显著相关性，具有统计学意义的影响因素较少，可能原因是食管鳞状细胞癌组织不够新鲜，样本量不足，肿瘤切片标本包含癌旁组织过多等，这些因素均会对研究结果造成偏差。

本研究结果显示，plexin-A4和PD-1阴性表达患者的5 a生存率显著长于阳性表达患者，提示plexin-A4和PD-1高水平表达会导致食管鳞状细胞癌患者5 a生存率降低。此外，本研究结果显示，分化程度、淋巴结的转移、PD-1表达水平为影响食管鳞状细胞癌患者的独立预后因素，提示低分化、有淋巴结转移、PD-1高表达水平预示更长的生存期，且PD-1可作为标记食管鳞状细胞癌患者预后的特异性标志物。

综上所述，食管鳞状细胞癌组织中plexin-A4和PD-1高表达可能促进食管鳞状细胞癌的发生发展，且PD-1高表达可作为监测肿瘤进展、临床治疗及预后评估的指标。但本研究样本量较少、未采用免疫组织化学法检测食管鳞状细胞癌癌旁组织中plexin-A4和PD-1蛋白的表达情况、未进行食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中plexin-A4和PD-1蛋白阳性表达率的比较，有待进一步完善。目前，对于plexin-A4和PD-1在食管鳞状细胞癌中的作用机制尚不明确，未来仍需进一步探讨。