饲粮发酵棉籽粕水平对28～70日龄马冈鹅生长性能、屠宰性能、肠道形态结构及回肠黏膜免疫屏障相关基因表达的影响

2021-08-09申佳佳陈俊鹏许克铨王旭龙王文策朱勇文

动物营养学报 2021年7期

申佳佳汪珩张艺陈俊鹏许克铨王旭龙王文策朱勇文* 杨琳*

(1.华南农业大学动物科学学院，广东省动物营养调控重点实验室，广州 510642；2.汕头市白沙禽畜原种研究所，汕头 515800)

微生物发酵能够有效降解、转化饲料原料中抗营养因子，具有提高动物养分利用率等作用。饲料原料经微生物发酵后，营养价值得到较大提升，在家禽生产上的应用优势日益凸显[1]。研究表明，饲粮中添加适宜水平发酵豆粕或发酵菜籽粕可提高肉鸡蛋白质和氨基酸消化率，促进肌肉中氨基酸、脂肪酸、肌苷酸等风味物质沉积，改善肉品质[2-3]。棉籽粕的氨基酸种类丰富、比例合理，其养分含量接近豆粕[4]。但棉籽粕中的抗营养因子棉酚、环丙烯脂肪酸等可与动物消化道中的酶及蛋白质结合，降低蛋白质消化率；同时抑制肠道矿物质和六碳糖的转运，降低家禽生长性能[5]。而棉籽粕经发酵后可降低抗营养因子含量，提高养分利用率。目前，发酵棉籽粕实际生产应用主要集中在肉鸡和肉鸭上，且适宜水平的推荐量存在差异。研究表明，饲粮中添加6%发酵棉籽粕可提高鸡的生长性能，并通过影响鸡的能量代谢减轻脂肪沉积，降低腹脂和皮脂厚度[6-7]。王婷[8]研究证实，饲粮中添加9.0%～13.5%的发酵棉籽粕对肉鸭生长性能较为理想，且对肝脏发育、血液指标无显著影响。但目前发酵棉籽粕对肉鹅饲用价值的研究报道甚少，有待探索发酵棉籽粕在肉鹅饲粮中的适宜水平。因此，本试验旨在研究饲粮发酵棉籽粕水平对28～70日龄马冈鹅生长性能、屠宰性能、肠道形态结构及回肠黏膜免疫屏障相关基因表达的影响，以期为发酵棉籽粕在马冈鹅非常规饲料的配制应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试验设计

试验在汕头白沙禽畜原种研究所试验场进行。选用28日龄健康、体重相近的马冈鹅公鹅432只，采用单因素完全随机设计，随机分为6个组，每组6个重复，每个重复12只。试验期42 d。试验鹅采用地面平养，自由采食和饮水。

1.2 试验饲粮

试验所用发酵棉籽粕采用红曲霉、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母固态发酵。经测定，发酵前、后粗蛋白质含量分别为45.67%、44.26%，游离棉酚含量分别为940、440 mg/kg。

参照NRC(1994)鹅营养需要，以玉米-豆粕型饲粮为基础，6个等能等氮等纤维饲粮中发酵棉籽粕水平分别为0(对照组)、5%、10%、15%、20%和25%，游离棉酚含量分别为0、22、44、66、88和110 mg/kg。试验饲粮组成及营养水平见表1。

表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)

续表1项目Items发酵棉籽粕水平 Fermented cottonseed meal level/%0510152025营养水平 Nutrient levels2)代谢能 ME/(MJ/kg)11.8411.8411.8411.8411.8411.84粗蛋白质 CP17.0617.5217.6917.4417.0517.56粗纤维 CF5.705.705.705.705.705.70钙 Ca0.800.800.800.800.800.80非植酸磷 AP0.400.400.400.400.400.40苏氨酸 Thr0.700.700.700.700.700.70赖氨酸 Lys0.810.810.810.810.810.81蛋氨酸 Met0.360.360.360.360.360.36游离棉酚 FG/(mg/kg)022446688110

1.3 检测指标与方法

1.3.1 饲粮中粗蛋白质和游离棉酚含量测定

粗蛋白质含量测定：每组准确称取饲粮样品各0.5 g，置于消化管中，添加催化剂(K2SO46 g、CuSO40.4 g)，添加浓硫酸12 mL，消煮后上KJELTEC-2300型全自动定氮仪进行测定，记录氮含量，并计算粗蛋白质含量。

游离棉酚含量测定：每组准确称取1.00 g饲粮样品，置于三角瓶中，添加50 mL提取液(715 mL 95%乙醇，285 mL水，200 mL乙醚，0.2 mL冰乙酸)。室温振荡提取30 min，过滤(0.5滤膜)清液直接用于Agilent-1290型高效液相色谱仪测定，并计算游离棉酚含量。

1.3.2 生长性能

于70日龄当天08:00对试验鹅进行空腹称重(称前停饲6 h)，记录耗料量，统计各组试验鹅每日采食量和增重情况，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.3.3 屠宰性能

于70日龄时，从每重复中抽取接近该重复体重的2只鹅进行屠宰，颈静脉放血致死，用湿法拔毛沥干水分后称重，测定其屠宰性能。测定指标包括屠宰率、全净膛率、半净膛率、胸肌率、腿肌率、腹脂率。试验操作及指标的测定方法参照《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》(NY/T 823—2004)进行。

1.3.4 肠道发育和形态结构

取完整十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠，剔除脂肪和食糜后测量各部分长度并称重，计算得到各个肠段相对于试验鹅活重的相对长度(cm/kg)、相对重量(g/kg)。

根据对肠道发育具有显著影响的发酵棉籽粕水平，筛选0、5%、15%和25%组进一步研究饲粮发酵棉籽粕水平对肠道形态结构及免疫屏障相关基因表达的影响。取十二指肠、空肠、回肠肠段中部相同位置约1.5 cm，用磷酸盐缓冲液清洗3遍，置于4%甲醛固定液中，进行苏木精-伊红(HE)染色，结果由武汉赛维尔生物科技有限公司提供。

1.3.5 回肠黏膜免疫屏障相关基因mRNA相对表达量

闭锁小环蛋白-1(ZO-1)、闭合蛋白(Claudin)、咬合蛋白(Occludin)、核因子-κB(NF-κB)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-10(IL-10)基因的引物序列信息见表2，由上海生工生物技术有限公司合成，内参基因为β-肌动蛋白(β-actin)。采用Magen生物公司的RNA提取试剂盒提取样品总RNA，实时荧光定量PCR使用Quantifast STBR Green PCR kit试剂盒和Bio-rad CFX-96型荧光定量PCR仪进行，每个实时定量PCR设3个重复。PCR反应程序为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，56 ℃退火延伸30 s，总计40个循环。

表2 目的基因的引物序列信息

1.4 数据统计分析

采用SAS v6.12软件的GLM程序进行单因素方差分析，然后通过Duncan氏法进行多重比较，试验结果使用平均值和均值标准误(SEM)表示，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 饲粮发酵棉籽粕水平对28～70日龄马冈鹅生长性能的影响

由表3可知，饲粮发酵棉籽粕水平对28～70日龄马冈鹅ADG和ADFI无显著影响(P>0.05)，但对F/G有显著影响(P<0.05)。20%和25%发酵棉籽粕水平组的F/G显著高于对照组(P<0.05)，但与其他各组无显著差异(P>0.05)。

表3 饲粮发酵棉籽粕水平对28～70日龄马冈鹅生长性能的影响

2.2 饲粮发酵棉籽粕水平对70日龄马冈鹅屠宰性能的影响

由表4可知，饲粮发酵棉籽粕水平对70日龄马冈鹅屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率、腹脂率均无显著影响(P>0.05)，但对腿肌率有显著影响(P<0.05)。25%发酵棉籽粕水平组的腿肌率显著低于对照组(P<0.05)，但与其他各组无显著差异(P>0.05)。

表4 饲粮发酵棉籽粕水平对70日龄马冈鹅屠宰性能的影响

2.3 饲粮发酵棉籽粕水平对70日龄马冈鹅肠道发育及形态结构的影响

由表5和表6可知，饲粮发酵棉籽粕水平对70日龄肉鹅十二指肠、回肠、盲肠和总肠道相对长度以及空肠、回肠、盲肠、直肠和总肠道相对重量均无显著影响(P>0.05)，但对空肠和直肠相对长度以及十二指肠相对重量有显著影响(P<0.05)。25%发酵棉籽粕水平组空肠、直肠相对长度显著高于对照组和15%发酵棉籽粕水平组(P<0.05)，且十二指肠相对重量显著高于其他各组(P<0.05)。

表5 饲粮发酵棉籽粕水平对70日龄马冈鹅肠道相对长度的影响

表6 饲粮发酵棉籽粕水平对70日龄马冈鹅肠道相对重量的影响

由表7可知，饲粮发酵棉籽粕水平对十二指肠隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度，空肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度，回肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度均无显著影响(P>0.05)，但对十二指肠绒毛高度和回肠隐窝深度有显著影响(P<0.05)。随着饲粮发酵棉籽粕水平的增加，十二指肠绒毛高度呈现降低趋势，15%和25%发酵棉籽粕水平组十二指肠绒毛高度显著低于对照组(P<0.05)；随着饲粮发酵棉籽粕水平的增加，回肠隐窝深度呈现先降低后升高的趋势，15%发酵棉籽粕水平组回肠隐窝深度显著低于对照组(P<0.05)。

表7 饲粮发酵棉籽粕水平对70日龄马冈鹅肠道形态结构的影响

2.4 饲粮发酵棉籽粕水平对鹅回肠黏膜免疫屏障相关基因mRNA相对表达量的影响

由表8可知，饲粮发酵棉籽粕水平对回肠黏膜Claudin的mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)，但对回肠黏膜ZO-1、Occludin、NF-κB、IL-6、IL-10的mRNA相对表达量有显著影响(P<0.05)。25%发酵棉籽粕水平组的回肠黏膜ZO-1、Occludin、NF-κB、IL-6的mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，回肠黏膜IL-10的mRNA相对表达量显著低于对照组(P<0.05)。

表8 饲粮发酵棉籽粕水平对马冈鹅回肠黏膜免疫屏障相关基因mRNA相对表达量的影响

3 讨论

3.1 饲粮发酵棉籽粕水平对28～70日龄马冈鹅生长性能和屠宰性能的影响

棉籽粕中棉酚、环丙烯脂肪酸、植酸等抗营养因子含量过高会导致畜禽食欲下降、生长迟缓，影响机体正常代谢和生殖能力[9]。而棉籽粕经发酵后其中的抗营养因子得到有效降解，从而提高饲料利用率并改善家禽生长性能。目前，发酵棉籽粕的研究主要集中在肉鸡和肉鸭上。Tang等[10]和冯江鑫[11]等先后证实5%～8%发酵棉籽粕能显著提高肉鸡生长性能，并显著降低F/G。闫理东等[12]发现生长期肉仔鸡饲喂9%发酵棉籽粕显著降低了ADG和ADFI。周联高等[13]和王雅倩等[14]在樱桃谷肉鸭上的研究表明，饲喂6%发酵棉籽粕其生长性能最好，效益最高，且胴体品质能够得到改善。而Zeng等[15]研究发现，饲粮33.11%发酵棉籽粕水平(游离棉酚含量152 mg/kg)显著降低了ADG和ADFI。上述研究结果不一致的原因可能与棉籽粕发酵工艺、饲粮抗营养因子含量高低及品种、生长阶段不同等因素密切相关。本试验结果表明，饲粮发酵棉籽粕水平(5%～25%)对28～70日龄肉鹅ADG和ADFI无显著影响，与Wang等[16]肉鸡方面的研究结果基本一致。但饲粮高水平(20%和25%)发酵棉籽粕引起28～70日龄肉鹅F/G显著增加。一方面，随着发酵棉籽粕水平增加，高剂量棉酚、植酸等抗营养因子与蛋白质、氨基酸、矿物质结合，使得肉鹅养分利用率下降[17]；另一方面，发酵棉籽粕中的棉酚对肠道中胃蛋白酶和胰淀粉酶等内源酶有直接的抑制作用，影响蛋白质和淀粉等营养物质吸收利用，从而影响饲料利用效率[18]。

屠宰性能方面，本试验发现饲粮发酵棉籽粕水平对70日龄马冈鹅屠宰率、半净膛率和全净膛率无显著影响，与Yu等[19]在肉鹅上屠宰性能的结果基本一致。但饲粮25%发酵棉籽粕水平显著降低70日龄肉鹅腿肌率，其原因可能是发酵棉籽粕中的棉酚与肌肉中的蛋白质形成复合物，抑制了蛋白质沉积，从而导致腿肌率降低[20]。而魏莲清等[21]等研究表明，饲粮中添加发酵棉籽粕可以显著提高肉鸡半净膛率和腿肌率，且6%发酵棉籽粕水平组腿肌率最高。上述研究结果不一致的原因可能是饲粮发酵棉籽粕水平不同以及不同物种对棉籽粕抗营养因子的耐受性高低有关。综合考虑本试验生长性能指标，建议28～70日龄肉鹅饲粮发酵棉籽粕水平控制在20%(游离棉酚含量88 mg/kg)以内。

3.2 饲粮发酵棉籽粕水平对70日龄马冈鹅肠道发育和形态结构的影响

3.3 饲粮发酵棉籽粕水平对马冈鹅回肠黏膜免疫屏障相关基因mRNA相对表达量的影响

肠上皮细胞肠屏障功能可保证肠腔内的物质与外界分离，防止病原体抗原入侵的功能。肠黏膜上皮细胞彼此相连，构成完整的生物屏障，细胞质膜蛋白与接头蛋白形成的蛋白网状结构是紧密连接的重要部分[32]。ZO-1是重要的细胞质接头蛋白，Occludin和Claudin是主要的细胞质跨膜蛋白[33]。这3种蛋白的表达减少或结构损伤可破坏肠道免疫屏障功能，致使肠壁通透性增加。本试验结果发现，25%发酵棉籽粕水平组的回肠黏膜ZO-1和Occludin的mRNA相对表达量显著升高；Claudin的mRNA相对表达量呈下降趋势，但并未达到显著水平。这与Wang等[34]在体外试验中的发现一致，高浓度棉酚可通过上调草鱼肠道细胞中磷肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的表达，下调Claudin-b的表达。饶渊[35]发现高棉籽粕水平组可显著下调蛋鸡空肠Occludin蛋白表达，其原因可能是鸡与鹅的物种属性差异导致其主体整体协调反馈机制不同，同时对于棉酚的耐受反应也不尽相同。肉鸡方面的研究发现，发酵棉籽粕中的棉酚、植酸等抗营养因子可诱导肠道细菌产生大量毒素，引起坏死性肠炎[36]。饲粮25%发酵棉籽粕水平(游离棉酚含量120 mg/kg)可显著上调肉鹅回肠黏膜的NF-κB和IL-6的mRNA相对表达量。研究表明，NF-κB是存在于多种细胞中的一种基因转录调控蛋白，受外界信息刺激活化，从胞浆进入胞核与炎性因子(如IL-1、IL-6等)基因启动子区域中的κB位点结合，启动炎性因子基因转录为mRNA，从而促进其合成，在炎症反应中起重要调控作用[37]。此外，肉鹅饲喂高水平发酵棉籽粕还可抑制抗炎细胞因子IL-10的表达，与在蛋鸡[38]和草鱼[34]方面的研究结果一致，可能与棉酚会加重生长期草鱼肠道组织病理学病变，降低肠道免疫功能有关。由此推测，发酵棉籽粕中的棉酚可能引起回肠的炎症反应，进而导致小肠绒毛高度下降等形态结构的破坏。但其促炎症反应等的机制是否通过NF-κB信号转导通路上调炎症因子表达来发挥作用，有待进一步研究。