脂肪酶的作用机理及分泌调节研究进展

闫昭明 刘霜莉 黄华山 陈清华*

(1.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128；2.山东隆科特酶制剂有限公司，临沂 276400)

畜牧业中抗生素的不规范使用，导致了病原微生物对抗生素的耐药性及畜产品中抗生素残留等问题。自2020年起，我国施行饲料端全面“禁抗”新举措。因此寻找良好的抗生素替代物将是目前的热点研究工作。其中，饲用酶制剂在实际生产中已经得到了广泛的应用。饲用不同种类酶制剂有助于提高动物对饲粮的养分消化率[1]，从另一个角度也侧面反映了饲粮营养价值的提高[2]。饲用酶制剂有助于加速消化道内营养物质的降解，并降低抗营养因子所带来的负面影响，降低食糜黏度同时促进谷物饲粮中非淀粉多糖(non-starch polysaccharides，NSP)的消化并产生低聚糖，进而影响肠道内微生物的数量及组成[3]。动物内源可分泌三大类消化酶，分别为蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶。其中蛋白酶和淀粉酶的研究较为完整和深入，但对于脂肪酶尤其是对于其分泌及消化的机制性研究还需要进一步完善。本文就脂肪酶的分类、作用机理、分泌调节进行综述，以期为脂肪酶的应用提供参考。

1 脂肪酶的种类及作用机理

脂质、碳水化合物、蛋白质共同构成机体的产热供能体系，也被称为健康所必需的“三大营养素”[4]，分别具有独特的生理功能，同时是动物维持正常生命活动的根本保证。脂质除是动物机体内的能量来源外，还是质膜及细胞膜的重要组成部分，在细胞内信号传导的过程中发挥介质的作用[5]。甘油三酯(triglyceride，TG)是动物机体内脂类物质的重要组成成分，主要储存于脂肪组织中[6]。动物机体对于能量的摄入和消耗之间的平衡关系在一定程度上决定了生物体结构和功能的完整性。当能量摄入量大于消耗量时，未能被消耗的能量将会转化为脂肪酸(fatty acid，FA)，并通过发生酯化反应生产TG储存于体内。而当能量消耗量较大时，TG也可发生脂解反应再次将FA释放出来[7]。

脂肪酶又称三酰基甘油酰基水解酶，是酯酶的一个分类，具有水解TG使之生成甘油和FA的能力。脂肪酶在自然界中来源广泛，动物、植物及微生物均具有生产脂肪酶的能力，其中动物脂肪酶多存在于消化道及胰腺等器官中[8]。大多数种类脂肪酶的最适存活温度在30～50 ℃，且适宜偏碱性的外部pH环境，活性也受金属离子及有机溶剂的影响[9]。目前，对脂肪酶的研究主要集中于脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)、激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)、单酰甘油脂肪酶(monoacylglycerol lipase，MGL)，这3种酶在机体内脂肪及非脂肪组织中对脂质代谢及分解具有明确的功能[10]。在TG的水解过程中，这3种酶表现出“顺序”催化的功能。即ATGL首先将TG水解为二酰甘油(diacylglycerol，DAG)和1分子FA；再由HSL继续催化，将DAG转化为单酰甘油(monoacylglycerol，MAG)和1分子FA；最后由MGL发挥催化作用，将MAG分解为甘油和FA[11]；为保证机体内水解平衡性，DAG和MAG还可通过二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)和单酰基甘油酰基转移酶(monoacyglycerol acyltransferases，MGAT)发生酯化过程再次生成TAG[12]，具体过程如图1所示。

TG：甘油三酯 triglyceride；DAG：二酰甘油 diacylglycerol；MAG：单酰甘油 monoacylglycerol；FA：脂肪酸 fatty acid；Glycerol：甘油；ATGL：脂肪甘油三酯脂肪酶 adipose triglyceride lipase；HSL：激素敏感脂肪酶 hormone-sensitive lipase；MGL：单酰甘油脂肪酶 monoacylglycerol lipase；DGAT：二酰基甘油酰基转移酶 diacylglycerol acyltransferase；MGAT：单酰基甘油酰基转移酶 monoacyglycerol acyltransferases。

1.1 ATGL

在2004年首次发现Patatin-like磷脂酶的结构域2(PNPLA2)，为简化其描述，也称为ATGL[13]。其主要功能为开始TG的水解过程，作为限速酶控制TG的水解速度[14]，并被认为是哺乳动物机体内脂滴与脂质周转过程中重要的水解酶[15]。通过ATGL免疫荧光发现其主要定位区域为细胞脂滴表面，说明其本质是一种脂滴蛋白[16]。

G0/G1开关基因2(G0/G1 switch gene 2，G0S2)与比较基因识别-58(comparative gene identification-58，CGI-58)这2种调节蛋白共同参与动物机体内ATGL的活化[17]。G0S2是一种重要的蛋白质，可通过调节细胞周期由G0期向G1期发生转变，进而表现为对细胞增殖活动的调控作用。同时其可作为一种内源选择性抑制剂抑制ATGL活性[18]，其机制可描述为G0S2的疏水结构区与ATGL中Patatin结构域以非竞争方式结合[19]，形成ATGL-G0S2复合体，从而减少TG的分解。CGI-58是ATGL发挥水解TG功能的辅助激活因子[20]，其本身不具有水解酶活性。在小鼠试验中发现，CGI-58数量的增加可提高TG水解酶的活性，但将ATGL基因敲除后却未表现出类似效果，说明CGI-58是通过特异性激活ATGL进而促进TG的水解，且CGI-58的数量也决定了ATGL的活性上限[21]。

过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma，PPAR-γ)在脂肪生成和脂肪组织发育的过程中是一种关键的调控因子。在ATGL水解TG的过程中，所产生的脂肪酸可作为信号分子调控由PPAR-γ介导的酯化耦联反应，以达到防止在脂质水解过程中出现内质网应激及TG的过量水解，维持脂肪细胞的结构及功能完整性[16]。此外，G0S2是PPAR-γ的靶基因，因其启动子区域包括PPAR-反应元件(PPAR-response element，PPRE)，PPAR-γ与PPRE发生特异性结合以上调G0S2基因的表达水平，进而对ATGL活性产生影响。G0S2在人和小鼠脂肪细胞形成过程中表达量显著上调，提示G0S2在负调控ATGL活性的同时也参与了机体内脂肪形成[22]。

1.2 HSL

HSL在机体内脂肪动员(TG的逐步水解，其产物经血液运输至不同组织被氧化利用的过程)的过程中发挥作用，即调动储存的脂肪用于氧化供能[23]。其作为一种中性脂肪酶，对底物具有特异性的催化作用，主要分布于脂肪组织中，在肌肉及肾上腺、睾丸、胰腺等组织中也有少量表达[24]。多种抗脂解激素如胰岛素、前列腺素，脂解激素如胰高血糖素、肾上腺素、促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素，可作用于HSL并发生磷酸化或去磷酸化反应从而调控其活性，其具有2个磷酸化位点，位点1(调节位点)可被蛋白激酶A(protein kinase，PKA)和糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase，GSKS)磷酸化，外源应用胰岛素可通过腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)依赖的方式活化环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)磷酸二酯酶，以加速cAMP水解的形式抑制PKA活性，从而降低HSL活性[25]。近年来研究表明，白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)可通过增加cAMP数量，增强PKA的活性，使HSL的丝氨酸563及660位点发生磷酸化，以提高HSL活性，磷酸化HSL(p-HSL)可由细胞基质向脂滴表面发生转移同时表现出解脂的功能[26]。位点2(基础位点)磷酸化受AMP-活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium-CaM-dependent protein kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ)共同调控[27]。

1.3 MGL

MGL属于丝氨酸水解酶家族，是TG实现完全水解过程中的一种关键酶，也是MAG降解的限速酶[28]。在组织水平上，MGL主要存在于大脑、心脏、脂肪组织、肾脏、睾丸、卵巢等中并表现出特异性；在细胞层面上，MGL主要存在于细胞质、质膜及脂滴中[29]。对其底物选择性的研究发现，相较于饱和脂肪酸形式的底物，MGL对不饱和脂肪酸形式的底物的水解活性较强，底物脂肪酸的不饱和程度对于MGL活性也有显著影响，MGL对于花生四烯甘油的水解效率高于棕榈酰甘油[30]。

MGL可将内源性大麻素(2-arachidonylglycerol，2-AG)水解为花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，AA作为一种二十烷酸衍生物的活性物质，具有丰富的生理功能，目前MGL-(2-AG)-AA水解代谢途径已逐步成为研究热点[31]。也有研究表明，MGL与多种病理及生理过程的发生有关，癌症细胞中MGL水解TG的过程中诱导如溶血磷脂酸、前列腺素、溶血磷脂及溶血磷脂乙醇胺等信号分子的表达，其中溶血磷脂酸及前列腺素等可诱发肿瘤的发生和发展[32]，提高生殖系统癌症、黑色素瘤的发生率及转移性，同时影响肠道功能的正常表达[33]。有研究表明，敲除MGL基因可通过抑制肝脏中关键的脂肪生成酶，如固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)、PPAR-γ2、二脂酰甘油酰基转移酶-1(diacylgycerol acyhransferase-DGAT-1)的表达，从而促进FA氧化并防止小鼠肝脏脂肪变性的发生，但小鼠性腺中白色脂肪生成量增加，并未对脂肪分解产生影响[34]。

2 脂肪酶的分泌调节

动物消化道内主要包括舌脂肪酶、胃脂肪酶和胰脂肪酶3种，胃脂肪酶在脂质水解的过程中发挥辅助作用，并对胰脂肪酶的分泌起调控作用[35]。就分泌部位而言，舌脂肪酶及胃脂肪酶也可统称为十二指肠前脂肪酶，胰脂肪酶称为十二指肠内脂肪酶。由胰腺分泌的胰脂肪酶可直接影响小肠对于FA的吸收，故被认为是最重要的内源脂肪酶[9]。同时，胰脂肪酶分泌能力的强弱是衡量动物对脂肪消化能力高低的重要指标[36]。由肝细胞分泌产生的含有胆汁酸、甘油胆酸等成分的胆汁可对脂肪进行乳化，从而起到辅助脂肪酶消化的作用。

影响脂肪酶分泌的因素是多方面且复杂的。动物不同生理阶段及健康状况下脂肪酶活性均有差别，母猪哺乳期对脂质的利用效率最高[37]。畜禽均表现出“为能而食”的特点，添加油脂可提高猪饲粮能量水平。Liu等[38]通过应用不同能量水平饲粮饲喂断奶仔猪后发现，高能饲粮组仔猪十二指肠及空肠内脂肪酶活性较高，提示饲粮能量水平与猪机体内脂肪酶的分泌存在交互效应。以上试验结果在肉鸡能量摄入与脂肪酶分泌的研究中得到了验证[39]。此外，某些重金属如铜元素可作为脂肪酶的激活剂，并通过抑制消化道内有害菌生长、繁殖而提高动物肠道健康水平，促进营养物质的利用[40]。克曌地[41]探究不同金属离子在体外条件下对脂肪酶水解能力的影响，发现Sn2+、Fe3+、Fe2+、Ca2+、Mg2+均可促进脂肪酶水解能力的提高，但Zn2+则会降低脂肪酶的活性。激素对脂肪酶的分泌调节研究较为深入，HSL被认为是机体内脂解过程中受激素调控的主要因子，但对猪ATGL基因激素敏感性的研究发现，ATGL在激素诱导的脂肪水解过程中也发挥了作用。相较于自由采食，在限饲条件下，猪机体内胰岛素水平较低，胰岛素以负反馈调控形式促进ATGL的产生[42]。同时，饲粮组成及加工工艺、环境因素等都会对脂肪酶的分泌和脂质的消化吸收产生影响。

目前对于外源酶补充是否影响动物内源酶分泌的观点主要分为2类：第1类即少量添加外源酶有提高机体消化酶水平的作用，但过量补充则抑制胰内源酶的分泌；第2类则不支持“反馈性抑制”理论，原因在于外源补充酶多由细菌或真菌在体外发酵生产，其结构和性质与内源酶存在区别[43]。为探究内、外源酶制剂是否存在交互分泌机制，应先探究酶制剂分泌的方式。以胰脂肪酶为例，胰腺内腺泡细胞核中基因发生转录作用生成mRNA，并通过翻译、修饰、包膜作用形成酶原颗粒，后经高尔基体参与细胞分泌活动，以胞吐形式将酶释放至胰管中，并进入十二指肠发挥酶解功能[44]。但目前，对于外源添加脂肪酶是否可以在转录及翻译水平上调控动物机体内源脂肪酶的分泌还鲜有报道。

在畜禽的养殖实践中，Liu等[38]在断奶仔猪低能饲粮中添加150 mg/kg的脂肪酶后发现，其虽未能影响仔猪生长性能，但可在提高养分表观消化率的基础上同时提高十二指肠及回肠的脂肪酶活性，并对肠道内蛋白酶活性也有提高效应。Chen等[45]在仔猪饲粮中添加200 mg/kg的未包被脂肪酶或包被脂肪酶后也得到了类似的结果，且包被脂肪酶的效果更佳。包被的主要功能是可进一步保证酶的结构完整及生理活性，将脂肪酶在特定部位进行释放，使之免受胃蛋白酶的消化从而降低损失[46]。Hu等[47]以肉鸡为试验动物，在低能饲粮中添加的脂肪酶也可促进胰脂肪酶活性的提高，并达到提高饲料转化率及生产性能的目的。幼龄动物对脂质的消化能力较弱，主要与消化系统未能完全发育有关。断奶应激是导致仔猪生长受限的主要原因，这一阶段仔猪的营养物质来源从液体饲粮向固体饲粮过渡，仔猪脂肪酶、蛋白酶的分泌减少并引起腹泻的发生[48]。动物消化道脂肪酶活性随着日龄不断增加，对脂质的利用效率得以提升[49]，主要原因是对于饲粮中饱和脂肪酸的消化率增加[50]。3周后，仔猪脂肪酶分泌量达到正常水平，故仔猪阶段外源补充脂肪酶的有效期为仔猪断奶后3周内[51]。

3 小结与展望

脂肪酶在畜牧业中的应用具有提高动物生产性能、缓解饲料资源短缺、利于环境保护等功能，在仔猪生产中的应用更表现出降低腹泻率的效果[52]，是防治仔猪断奶腹泻的良好选择之一。目前通过微生物发酵的手段生产脂肪酶的技术(液体深层发酵)已经逐步成熟，也已实现对曲霉、假单胞酶、根霉等高效发酵菌种的筛选工作。但是脂肪酶多适宜在碱性环境下发挥生理功能，而动物消化道内主要为酸性环境。故还需通过发酵菌种改造、基因改良工程、发酵工程及后期工艺处理等方面进行进一步优化。

目前研究者已形成的共识是使用酶制剂对动物的生长是有益的，伴随单胃动物的不断生长，酶制剂的功能从补充内源缺乏[53]向通过微生物路径介导而对机体产生有益作用[54]。但在不同动物、不同生理阶段中应用不同酶制剂(单一或复合)所得到的结果并不统一，脂肪酶的应用亦是如此。故对于脂肪酶的分泌、作用机制及在机体内与激素、其他营养物质之间的互作效应还值得进一步研究。