茶多酚-姜黄素复配液对冻藏贻贝肉品质的影响

朱士臣,曾曦,龙官誉,吕飞,周绪霞,4,金友定,邓尚贵,周小敏,刘书来,4*,丁玉庭,4

1(浙江工业大学 食品科学与工程学院,浙江 杭州,310014)2(浙江省深蓝渔业资源高效开发利用重点实验室,浙江 杭州,310014)3(国家远洋水产品加工技术研发分中心(杭州),浙江 杭州,310014)4(海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心(大连工业大学),辽宁 大连,116034)5(嵊泗县景晟贻贝产业发展有限公司,浙江 嵊泗,316000)6(浙江海洋大学 食品与药学学院,浙江 舟山,316000)7(浙江兴业集团有限公司,浙江 舟山,316000)

贻贝(Mytilusedulis),是我国近海区域贝类养殖的重要品种之一。根据2020年中国渔业统计年鉴,2019年国内贻贝产量为90.34万t,占总贝类养殖的6.26%[1]。贻贝肉蛋白质含量高,干物质比例占60%以上,营养全面,富含多种生理活性物质。传统的热加工会造成贻贝肉的过度熟化,严重影响营养品质与风味,而适度热处理的贻贝虽能保留其鲜嫩口感及风味,但由于仍含有较高水分含量,需在低温下冻藏以保持其品质与安全性[2],此外,热处理后的贻贝肉冻藏期间会发生脂质氧化、水分损失、感官品质下降及组织结构变差等不良变化。因此,如何进一步提高预热处理贻贝肉的冻藏品质是亟需解决的问题。

为提高水产品的冻藏品质,研究人员分别从抑制冰晶生长和稳定食品组分方面做了大量研究。通过添加外源性物质以增强食品组分稳定性是主要的研究方向之一。例如,JU等[3]发现茶多酚对0和4 ℃贮藏18和12 d的沙蚕具有较好的保鲜效果,如抑制挥发物腐败、降低挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)、硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid,TBA)、过氧化值和菌落总数,质地和感官可接受性也更高。XI等[4]将牡蛎肉浸泡在绿茶提取物溶液中,减少了副溶血性弧菌的数量,延长了其低温常压下的保质期。林以琳等[5]研究缢蛏保鲜技术,优化出最佳浓度的姜黄素溶液,结合光动力技术,达到减菌目的。WANG等[6]研究发现,姜黄素微胶囊对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌等具有很好的抗菌活性,抑制效果革兰氏阳性菌高于革兰氏阴性菌,真菌优于细菌。目前姜黄素在贝类中的应用研究表明,2.75 g/L为最有效的抑菌浓度[7]。茶多酚具有抗氧化作用,但抑菌作用范围较小且抑菌效果有限[8],如果能将茶多酚与姜黄素结合使用,将能弥补这一缺陷。

为进一步改善贻贝肉的冻藏品质,本文以热处理的贻贝肉为研究对象,采用不同比例的茶多酚-姜黄素复配液进行浸泡处理,研究-18 ℃冻藏期间贻贝肉的理化特性、感官品质、菌群组成以及微观结构的变化,探究其中的调控规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活厚壳贻贝,杭州朝晖农贸市场,质量(50±5)g；白葡萄酒,中粮长城酒业有限公司；茶多酚(食品级),河南万邦实业有限公司；姜黄素(食品级),扬州中信食化商贸有限公司；茶多酚标准品,南京道斯夫生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-6100S分光光度计,上海美谱达仪器有限公司；Waters 2695型高效液相色谱仪,美国Waters公司；Aqualab 4TE水分活度仪,美国METER公司；K9840全自动凯氏定氮仪,济南海能仪器有限公司；TA.XT Plus物性测试仪,英国Stable Micro Systems公司；S-3400 N扫描电子显微镜,东京Hitachi高科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

以3.5%乙醇含量的白葡萄酒为姜黄素的助溶剂,分别配制不同质量浓度的茶多酚(30、15、7.5 mg/mL)与姜黄素(2.75 mg/mL)复配液。鲜活贻贝经100 ℃热水处理1 min,开壳至蛋白质变性程度为50%,去足丝,随机分为4组,于茶多酚复配液中浸泡60 min(TC1、TC2、TC3),3.5%白葡萄酒溶液处理为对照组(CK),蒸馏水处理为空白组(C0),沥干装入自封袋中,于-18 ℃的冰箱中贮藏。贮藏过程中每周分别取样进行指标测定。

1.3.2 肌原纤维蛋白的提取及测定

参考LI等[9]的方法并稍做修改。取5 g贝肉,加入75 mL的0.05 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-马来酸溶液(pH 7.0),匀浆,10 000 r/min离心20 min,循环2次取沉淀；再加入75 mL的0.6 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-马来酸溶液(pH 7.0),匀浆,4 ℃抽提1.5 h。然后4 ℃、10 000 r/min离心20 min,取上清液,通过双缩脲法测定肌原纤维蛋白含量。

1.3.3 持水力和水分活度测定

持水力测定参照QIAN等[10]的方法并做了修改。取5.00 g贻贝肉,70 ℃水浴处理20 min,5 000 r/min离心3 min,滤干称质量,按公式(1)计算持水力：

持水力/%=

(1)

水分活度测定：取约 2.00 g贻贝肉切碎后,均匀平铺于样品盒中,放入水分活度测定仪感应器中[11]。

1.3.4 贻贝肉中茶多酚含量测定

称取5.00 g试样于250 mL具塞锥形瓶内,加入50 mL正己烷振荡提取,用滤纸过滤至250 mL圆底烧瓶内,重复3次,合并滤液,于40 ℃水浴中旋转蒸发至近干。加入少许甲醇,振摇溶解提取液,移入10 mL离心管中,用少量甲醇冲洗圆底烧瓶3次,洗涤液并入离心管中,定容至10 mL,混匀、涡旋、冷冻离心。上清液过0.45 μm微孔滤膜过滤,滤液进高效液相色谱测定[12]。

1.3.5 菌落总数测定

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》并做修改。分别在(30±1)℃、(20±1)℃下培养72 h,测得贝肉的菌落总数和嗜冷菌数[13],以 lg CFU/g 计数。

1.3.6 TBA测定

准确称取10.00 g贝肉，参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》方法。

1.3.7 TVB-N检测

准确称取10.00 g贝肉,根据GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》方法。

1.3.8 质构测定

参考沈军樑[14]的方法并略有改动。以贝肉中心为测试点,探头为P36R,触发力5 g,应变50%,测试前速率 2 mm/s；测试速率 1 mm/s；测试后速率2 mm/s。

1.3.9 微观结构的测定

参考SYAMALADEVI等[15]的方法,将贻贝肉切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm大小,用2.5%戊二醛溶液固定,随后用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)漂洗3次,每次15 min,再分别用浓度梯度为50%、70%、80%、90%和100%的无水乙醇进行脱水处理,每次15 min,最后进行冷冻干燥。冻干样品用不锈钢刀片切成2～3 mm薄片,喷金,在扫描电镜下进行观察(×25 000)。

1.3.10 感官评价

建立贻贝肉产品的QIM(quality index method)评分表[16],如表1所示。由15名经过一定感官评定培训的人员进行感官评价。

表1 贻贝肉的感官评价标准

1.3.11 数据分析与处理

每组处理至少重复3次,采用SPSS 26.0进行平均值和标准差的统计分析,采用Duncan多范围检验进行单向方差分析(P<0.05),采用Origin 2018做图。

2 结果与分析

2.1 持水力和水分活度的变化

图2为冻藏期间贻贝肉持水力与水分活度的变化情况。由图1-a可知,在冻藏前期(0～6周),各处理组贻贝肉的持水力均呈显著下降趋势(P<0.05),之后逐渐趋于稳定。茶多酚复配液处理组的持水力显著优于C0组和CK组(P<0.05),其中TC1>TC2>TC3,冻藏末期表现得更明显,而C0组和CK组间无明显差异。不同样品组间的水分活度也表现了相似结果(图1-b),即茶多酚浓度越高,水分活度也较高。可能是由于在冻藏期间,贻贝的肌肉组织在冰晶机械作用下受到不同程度的破坏,造成贝肉持水力下降。细菌的生长繁殖也破坏了肌肉的组织结构[17]。

a-持水力;b-水分活度

经茶多酚-姜黄素复配液处理后,茶多酚通过氢键和疏水键方式与肌原纤维蛋白结合,增大了贝肉表面的收敛性,减少了水分丧失[18],且多酚可抑制微生物繁殖,一定程度保持了贻贝肌肉组织结构,减少了汁液流失。

2.2 TVB-N变化

TVB-N是衡量海产品新鲜度和质量的最广泛使用的评价指标之一,该值与腐败菌的活性有关。腐败菌的生长加快蛋白质、氨基酸类物质分解成挥发性含氮物质,该值越低,说明贻贝肉鲜度品质越高。本文主要参考国家标准中规定预制动物性水产制品中TVB-N的限量不得超过不得超过30 mg/100 g(GB 10136—2015《食品安全国家标准 物性水产制品》)。冻藏过程中贻贝肉的TVB-N随冻藏时间的变化情况见图2-a,-18 ℃冻藏下,C0和CK组贻贝肉在第10周已超过30 mg/100 g的限量标准值,而复配液处理的贻贝肉贮藏期都有所延长,茶多酚浓度越大,TVB-N值上升越慢,说明茶多酚和姜黄素对延长贮藏期具有显著的效果。茶多酚具有很强的还原性,能将作用于肌肉上的氧自由基还原成相对稳定的化合物,使蛋白质结构不易被降解[19]；同时姜黄素可作用于细菌的膜系统和生物酶系统,达到干扰其能量代谢和选择透过性,也赋予了较强的抗菌效果[20]。

2.3 TBA变化

贻贝肉中脂肪占干重的8%～9%,仅次于碳水化合物,脂质中多为不饱和脂肪酸,易发生氧化。冻藏过程中贻贝肉TBA的变化情况见图2-b,在-18 ℃冻藏12周贻贝肉的TBA值分别是(4.59±0.05)、(4.50±0.10)、(2.83±0.08)、(3.30±0.19)、(3.80±0.10) mg MDA/kg。复配液处理组的TBA值显著低于C0、CK组(P<0.05),其中TC1复配液作用效果显著优于其他4组(P<0.05)。研究表明,迷迭香和D-抗坏血酸钠能明显延缓青鱼干腐败变质,在贮藏后期的作用效果更明显[21]。ZHOU等[22]发现紫贻贝肉4 ℃冷藏第4天时,TBA值由0.89 mg MDA/kg上升至4.06 mg MDA/kg,在贮藏后期上升幅度越大。目前虽然国际上没有明确规定TBA对应的品质上限值,但有研究表明,当TBA>2 mg MDA/kg时,会产生令人不快的气味或味道[23],这与TVB-N结果是相对应的。

2.4 菌落总数与嗜冷菌的变化

冻藏贻贝肉的品质变化主要由嗜冷菌的繁殖引起,嗜冷菌含量是反映其食用安全的一项重要指标[24]。综合嗜冷菌和菌落总数可全面反映不同处理条件下冻藏过程中贻贝肉微生物的生长繁殖情况。在-18 ℃冻藏条件下贻贝肉微生物变化见图3。由于前期预处理杀灭了大部分细菌,因此贮藏初期(0 d)所有样品组的菌落总数和嗜冷菌均保持较低水平(0.5 lg CFU/g)。根据国际食品微生物规范委员会(International Commission on Microbiological Specifications for Foods,ICMSF)的规定,菌落总数和嗜冷菌的上限为6 lg CFU/g,在此限值以下,甲壳类水产品都能保持较好的鲜度[25]。按此标准,菌落总数(图3-a)分别在第10周、第10周、第12周、第12 周和第10周超过标准限量值,而嗜冷菌(图3-b)分别在第10周、第10周、第12周、第10周和第10周超过标准限量值。冻藏过程中TC1、TC3和TC3组的菌落总数和嗜冷菌数明显要低于C0和CK组,TC1组的2种菌数量最少。茶多酚和姜黄素为酚类、萜类物质,已被证实能在菌体细胞膜上聚集,改变细胞膜的通透性,从而抑制微生物的生长[26]。

a-菌落总数;b-嗜冷菌

2.5 肌原纤维蛋白变化

贻贝肉中蛋白变性越严重,其盐溶性蛋白也就越低,本文以其肌原纤维蛋白的含量变化作为衡量标准,观察复配液的保鲜效果。研究发现,冻藏下的贻贝肉肌原纤维蛋白含量从最初的260 mg/g干物质降至冻藏期结束时的130 mg/g干物质(图4)。

图4 贻贝肉肌原纤维蛋白含量随冻藏时间的变化情况

冻藏2周时,各组间无明显差异,从第2周开始至冻藏期结束,添加了茶多酚-姜黄素复配液的3组处理组,肌原纤维蛋白的含量明显高于同期的C0、CK组(P<0.05),TC1组效果最好,冻藏第12周时,肌原纤维蛋白含量还能保持在148 mg/g干物质。-18 ℃冻藏过程中,贻贝肉蛋白质中结合水在细胞外产生大冰晶,细胞内肌原纤维被挤压成束状,导致蛋白质结合形成各种不溶性交联而变性；另外,蛋白质氧化变性导致肌球蛋白间的交联作用减弱,凝胶特性下降[27]。茶多酚和姜黄素作为抗氧化剂,能有效抑制蛋白质氧化的发生,减缓凝胶弹性和持水能力的下降[28]。

2.6 质构变化

冻藏过程中冰晶生成会造成肌肉组织结构的破坏,从而导致贻贝肉硬度、弹性和咀嚼性的下降,肌肉组织口感变差[29]。由表2可知,随冻藏期延长,贻贝肉的硬度、弹性和咀嚼性均呈下降趋势(P<0.05),但冻藏8周后都趋于稳定；贻贝肉经茶多酚-姜黄素处理后咀嚼性和弹性显著高于C0、CK组(P<0.05),而C0组和CK组间无明显差异；与TC2、TC3相比,冻藏期间TC1处理组的贻贝肉质构更稳定,冻藏结束时,其硬度、弹性和咀嚼性表现也较好。贻贝肉的质构与水分、蛋白质和脂肪密切相关,冻藏期间水分的流失、冰晶的形成、蛋白质和脂肪的氧化均是引起质构变化的关键因素[30]。研究表明,天然植物中的抗氧化成分能有效抑制肌肉中蛋白质和脂肪的氧化,从而改善肉制品的质构[31]。茶多酚和姜黄素具有较强的抗氧化性和抑菌性,能够抑制贻贝肉中脂肪和蛋白质的氧化腐败,从而一定程度上减缓冻藏期间质构的降低,这与本论文结果相类似。

表2 不同复配液处理的贻贝肉质构的变化

2.7 感官评价分析

冻藏期间贻贝肉感官变化情况如图5所示,C0和CK组4指标的评分值始终低于处理组,C0冻藏第12周时气味和质地甚至已经低于60分,且贻贝肉开始腐败,表面黏液增加,产生异味,发生色变,肉质结构软烂；而处理组贻贝肉的外观、色泽和气味都有所改善,尤其是气味方面。这是因为茶多酚和姜黄素的抗氧化和抗菌性能有效抑制微生物的生长,降低TVB-N的含量,延缓脂肪的氧化程度,从而减少胺类等小分子物质的产生[32]。另外,作为溶剂的白葡萄酒本身带有香味,能在一定程度上能掩盖、中和一部分不愉快的气味,从而使得复配液处理组具有较高的感官得分。

a-外观；b-色泽；c-气味；d-质地

2.8 微观结构分析

扫描电镜结果表明,经过TC1组茶多酚复配液处理后冻藏贻贝肉的套膜、外展肌和生殖腺组织结构并非一致(图6)。冻藏第0周的贻贝肉套膜、外展肌和生殖腺(A1～A3、C1～C3)肌肉组织分布较均匀,条状或颗粒状纤维结构仍存在；而冻藏12周后贻贝肉则出现显著变化,3个部位都显现出结缔组织和肌纤维的严重变形,彼此间发生黏连、轮廓不清晰,尤其是生殖腺呈现扭曲状态,显微结构消失(B1～B3、D1～D3)。但与空白组相比,实验组的贝肉形变程度相对较小。ANGANE等[33]在研究冷冻对贻贝肉不同部位显微结构的影响时发现,新鲜热脱壳贻贝的性腺、套膜和足部组织结构完整,肌纤维分布均匀,而冻存90 d的样品中,性腺出现扭曲,具有大量的细胞内和细胞外空间,套膜由于冰晶的形成而显示出巨大的孔隙。

1-套膜；2-外展肌；3-生殖腺；A-空白组0周；B-空白组12周；C-实验组0周；D-实验组12周

2.9 茶多酚含量分析

图7为冻藏期间贻贝肉中茶多酚含量的变化情况,第0周时贝肉中茶多酚含量为266.79 mg/kg,符合国家规定的限量标准(≤0.3 g/kg，GB 2760—2014 《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》),冻藏至第8周,贝肉中茶多酚降至145.03 mg/kg,前4周茶多酚含量的变化具有显著性差异(P<0.05),从第8周至冻藏期结束,茶多酚含量保持稳定。

图7 贻贝中的茶多酚含量随冻藏时间的变化趋势

这可能由于茶多酚通过清除自由基和活性氧、抑制氧化酶及促进抗氧化酶活性的途径来实现抗氧化的目的,这一过程将茶多酚中的有效成分转化成了其他物质,造成茶多酚的损失[34]。另外,贻贝肉汁液的损失也将溶出一部分茶多酚物质,故而冻藏后期贝肉的氧化程度加深,TBA值显著提高,但此时茶多酚清除自由基的作用暂时达到平衡,不需要再消耗茶多酚进行清除工作,故茶多酚含量暂时保持平稳。

3 结论

结果表明,茶多酚-姜黄复配液能有效抑制贻贝肉的脂质氧化、延缓菌落总数的增加和嗜冷菌的生长,同时茶多酚-姜黄处理组在持水力、水分活度、TVB-N、质构和感官表现上也明显优于空白组和对照组,其中30 mg/mL茶多酚+2.75 mg/mL姜黄素复配液处理组效果最好,其处理贻贝肉的肌肉纤维状态较空白组和对照组有序,且茶多酚含量逐渐趋向稳定。研究证明,茶多酚和姜黄能一定程度提高贻贝肉冻藏期间的抗氧化性和抑菌性,30 mg/mL茶多酚+2.75 mg/mL姜黄素复配液可使贝肉在微生物限值的时间延长1～2周。因此,茶多酚-姜黄复配液可改善贻贝肉的冻藏品质,延长冻藏期。