微生物复合发酵沙蟹汁的制备工艺优化及其风味研究

边昊，陈柏宇，李锐

1(安徽工商职业学院,安徽 合肥，230041) 2(广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江，524088)3(岭南师范学院 生命科学与技术学院，广东 湛江，524048)

沙蟹汁是广西北海特有的传统美食，具有风味独特、口味鲜美等特点，常用来制作“沙蟹汁焖豆角”、“沙蟹汁蘸白切鸡”等当地特色名菜，深受人们的喜爱[1-2]。传统沙蟹汁是以海滩野生沙蟹为原料，清洗后去除内脏和污物，捣碎后混以一定比例的食盐放入发酵罐中，经过1个月左右的自然发酵后制得[3]。目前沙蟹汁的生产以传统方法为主，其产品存在腥异味重的问题，严重阻碍了产品的推广。

微生物发酵法是食品工业中常用风味改良方法之一，可以通过微生物作用将小分子腥味物质转变为无腥味的物质，同时还能产生特殊的发酵香味，从而达到“除臭增香”的目的[4]。目前食品行业多采用多种菌种复合发酵的方式，不仅可以弥补单一菌种发酵的缺陷，而且能缩短发酵时间[5-6]。解万翠等[7]在虾头酱中添加3种菌株(植物乳杆菌、黑曲霉和季氏毕赤氏酵母)进行混合发酵，大大提高了发酵效率，并增加了虾酱的风味。张晶等[8]采用复合菌和安琪酵母发酵野生猕猴桃果酒，显著提高了产品的香气品质，且口感更加醇厚。TURCHI等[9]使用2种混合菌株(植物乳杆菌和嗜热链球菌)对驴奶进行发酵，发现混合菌种的发酵产品整体品质要优于单一菌株。BERTUZZI等[10]采用协同发酵法(汉逊德巴利酵母、腐生葡萄球菌和干酪棒状杆菌)制备奶酪，发现奶酪色泽和品质发生明显改变。目前，采用复合发酵法制备沙蟹汁的研究尚未见报道。

植物乳杆菌是一种广泛存在于发酵食品中的微生物，对肉类风味形成有积极的促进作用[11]。鲁氏酵母菌是发酵食品行业中常用的增香型菌株，在发酵过程中会产生大量糖类物质，并伴随产生呋喃酮、芳香醇、高级醇等化合物，能显著提升产品的香气[12]。本文以沙蟹为原料，在传统工艺的基础上添加鲁氏酵母菌和植物乳杆菌进行发酵，以感官评分和氨基态氮含量为指标，采用单因素试验结合响应面分析法优化复合发酵沙蟹汁的制备工艺，并比较复合发酵沙蟹汁与传统沙蟹汁的风味成分，以期为沙蟹汁的风味改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙蟹，北海市回头客食品有限公司；生姜、食盐均为市售；IMP、GMP、ATP、ADP、AMP、HxR、Hx标准品(纯度≥99.0%)，美国Sigma公司；植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，菌种编号GIMI.191)和鲁氏酵母菌(Saccharomycesrouxii，菌种编号AS2.180)，中国科学院菌种保藏中心；YPD液体培养基、MRS液体培养基，青岛海博生物技术有限公司；ADP、HxR、Hx、GMP、AMP、ATP、IMP标准品，上海源叶生物科技有限公司；有机酸和氨基酸标准品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

MJ-160型恒温培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；L-P1200型粉碎机，郑州力威设备有限公司；L8900型氨基酸分析仪、LC-10AT型高效液相色谱仪，日本Shimadzu公司；LDZX-50KB型高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；FE28-Stan型酸度计，梅特勒-托利多仪器有限公司；MR-23i型冷冻离心机，法国Jouan 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 沙蟹汁的制备

传统沙蟹汁：取处理好的沙蟹1 kg、生姜末200 g和食盐300 g，搅拌均匀后加入500 g凉白开，然后使用均质机以8 000 r/min的条件均质3 min。均质好的混合溶液(pH 7.5～8.0)装入干净的发酵罐，晾晒发酵15 d(日晒夜露，25 ℃左右)，所得产品即为传统沙蟹汁。发酵结束后将沙蟹汁混合均匀，并于4500 r/min条件下离心15 min，取上清液保存于-20 ℃备用。

复合发酵沙蟹汁：按上述相同方法均质,均质好的混合溶液调节pH值，加入一定量的复合发酵剂，混合均匀后置于恒温培养箱静置发酵，所得产品为复合发酵沙蟹汁。发酵结束后将沙蟹汁混合均匀，于4 500 r/min条件下离心15 min，取上清液保存于-20 ℃备用。

1.2.2 菌悬液的制备

参考李锐等[12]的方法，稍作改动。将植物乳杆菌和鲁氏酵母菌分别接种到MRS液体培养基和YPD液体培养基中。植物乳杆菌于37 ℃恒温培养箱振荡培养22 h，连续传代2～3次至活力恢复。鲁氏酵母菌于30 ℃恒温培养箱振荡培养40 h，连续传代2～3次至活力恢复。培养结束后，菌悬液离心(4 ℃，4 000 r/min，时间15 min)，收集菌体沉淀并溶于灭菌生理盐水(0.85 %)，最终调整菌悬液菌落个数为108CFU/g。

1.2.3 复合发酵法改良沙蟹汁的单因素试验

微生物复合发酵法改良沙蟹汁的固定条件为：植物乳杆菌和鲁氏酵母菌混合比例3∶2，发酵时间17 d，发酵温度26 ℃，复合发酵剂接种量5%(以混合溶液总质量为计)，发酵初始pH 7.5。固定其他条件不变，改变其中某个因素条件分别分析对复合发酵沙蟹汁感官评价及氨基态氮含量的影响。设置各因素的梯度分别为：植物乳杆菌和鲁氏酵母菌混合比例 0∶3、1∶3、2∶3、1∶1、3∶2、3∶1、3∶0，发酵时间13、15、17、19、21、23、25 d，发酵温度20、22、24、26、28、30、32 ℃，复合发酵剂接种量1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，发酵初始pH值6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。发酵结束后灭菌，冷却后样品备用。

1.2.4 响应面分析法优化复合发酵法改良沙蟹汁的最佳工艺

根据单因素实验确定发酵温度、发酵时间和发酵剂接种量3个因素为自变量，以感官评分为响应值，采用响应面分析法优化复合发酵法改良沙蟹汁的最佳工艺条件。试验因素与水平见表1。

表1 响应面因素与水平设计

1.2.5 感官评价

参考边昊等[13]的方法，通过感官描述法对沙蟹汁的感官属性进行分析。挑选10名感官评价员(6名女性和4名男性，年龄19～30岁)，所有的评价人员均在食品感官分析领域有着丰富的经验，并熟悉各种感官描述词汇。感官评价前，将样品置于50 ℃水浴锅中恒温加热10 min,并分别装入5个同样的容器，评价时随机取样。根据感官评定标准(表2)，评价人员对沙蟹汁的色泽、香气、滋味和形态进行打分，最后取10位评价人员的平均值作为最终评分。

表2 感官评定标准表

1.2.6 其他理化指标的测定

氨基态氮含量的测定参考王雪锋等[14]的方法；挥发性盐基氮(total volatile basic nitragen,TVB-N)的测定参考吴燕燕等[15]的方法。

游离氨基酸含量的测定参考宓月光等[16]的方法，稍有改动。取沙蟹汁1.0 g，加入3 mL 质量浓度为50 g/L磺基水杨酸溶液，混合均匀后静置1 h，于9 000 r/min条件下离心15 min，取上清液并使用水系微孔滤膜过滤(0.22 μm)，然后用L8900型氨基酸分析仪进行测定。

有机酸含量测定依据段珍珍等[17]的方法，稍有改动。取沙蟹汁5.0 g，加25 mL超纯水混合均匀，然后使用均质机以10 000 r/min的条件均质10 min，于7 000 r/min条件下离心10 min，取上清液用超纯水准确定容至50 mL。样品液使用水系微孔滤膜过滤(0.22 μm)，用高效液相色谱仪进行分析。

呈味核苷酸含量的测定参考YANG等[18]的方法，稍有改动。取沙蟹汁5.0 g，加入30 mL质量浓度为0.05 g/mL的高氯酸溶液，使用均质机以10 000 r/min的条件均质10 min，于7 000 r/min条件下离心10 min。取沉淀加入10 mL质量浓度为0.05 g/mL的高氯酸溶液再次提取，重复操作2次，合并两次离心后的上清液，使用浓度为5 mol/L的KOH溶液调节pH为6.75，用超纯水准确定容至50 mL。样品液用水系微孔滤膜过滤(0.22 μm)，使用高效液相色谱仪进行分析。

1.3 数据处理

每个数据设置3个重复，结果用平均值±标准偏差表示，使用Design-Expert 8.0.6、IBM SPSS 22.0和Origin 8.0软件进行作图和数据分析。

2 结果与讨论

2.1 复合发酵改良沙蟹汁的单因素试验

以感官评分和氨基态氮含量为指标，植物乳杆菌和鲁氏酵母菌混合比例、发酵时间、接种量、发酵温度和发酵初始pH值5个单因素试验结果如图1所示。

a-菌种混合比例;b-发酵时间;c-发酵剂接种量;d-发酵温度;e-发酵初始pH

由图1-a可知，不同混合比例对沙蟹汁的感官评分和氨基态氮含量有较大影响。在所有混合比例中，菌种混合比例3∶2时沙蟹汁的感官评分最高，为6.94；菌种混合比例1∶3时沙蟹汁的氨基态氮含量最高，为(5.31±0.07) mg/mL，其次为菌种混合比例3∶2，氨基态氮含量为(5.25±0.13) mg/mL，两者之间没有显著性差异(p<0.05)。综合考虑，选择植物乳杆菌和鲁氏酵母菌混合比例为3∶2。由图1-b可知，随着发酵时间的延长，沙蟹汁的感官评分逐渐增加，于发酵17 d时感官评分达到最大值7.85，此时氨基态氮含量为(5.33±0.07) mg/mL，说明此时沙蟹汁发酵风味已趋于成熟。发酵17 d后沙蟹汁的感官评分和氨基态氮含量缓慢下降，这可能是由于在发酵后期，菌种产生有机酸、乙醇等次级代谢产物，使得沙蟹汁风味劣化[13]。因此，选择发酵17 d较为合适。由图1-c可知，随着接种量的增加，沙蟹汁的感官评分呈先上升后下降的趋势，并于接种量为5%时感官评分达到最大值7.44，此时氨基态氮含量为(5.33±0.07) mg/mL。继续增加接种量，沙蟹汁的感官评分开始下降。有研究表明，发酵液中酵母菌过多会产生酵母味、酸味和酒精味，导致香气品质下降[19]。因此，选择接种量5%较为合适。发酵温度是影响发酵产品质量的重要因素之一。由图1-d可知，发酵温度低于26 ℃时，沙蟹汁感官评分较低，此阶段菌株代谢活动缓慢，风味变化不明显；当高于26 ℃时，发酵液中微生物的代谢活动被抑制，导致风味物质浓度降低，氨基态氮含量也有所下降，因此选择发酵温度26 ℃较为合适，此时氨基态氮含量为(5.98±0.05) mg/mL。由图1-e可知，随着发酵初始pH值的增加，沙蟹汁的感官评分和氨基态氮含量呈先上升后下降的趋势，在pH值为7.5时，感官评分最高，为7.03，此时氨基态氮含量为(5.41±0.04) mg/mL。微生物在最适pH值时代谢速率最高，高于或低于这个值，均会降低菌株的代谢速率。因此，选择最佳发酵初始pH值为7.5。

2.2 响应面优化复合发酵法改良沙蟹汁的制备工艺

2.2.1 响应面分析试验设计

由单因素试验结果可知，发酵温度、发酵时间和发酵剂接种量3个因素对沙蟹汁感官评价的影响较大。在此基础上，根据Box-Behnken设计原理，以感官评分为响应值，发酵时间(A)、发酵温度(B)和发酵剂接种量(C)为自变量，采用响应面优化沙蟹汁发酵最佳工艺条件。响应面因素与水平见表2。

2.2.2 响应面结果及方差分析

响应面试验设计方案及结果见表3。利用Design Expert 8.0.5软件对试验结果进行回归拟合，并对数据进行方差分析，去除不显著项得到回归方程为：y=7.28+0.24A+0.24B-0.2AC- 0.83A2-0.77B2-0.27C2。

为了检验方程的有效性，对模型方程进行方差分析，结果如表4。

表4 回归模型方差分析

*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)

2.2.3 复合发酵法改良沙蟹汁最优工艺与验证试验

利用Design Expert 8.0.5软件得到最佳发酵条件为：发酵时间17.3 d，发酵温度26.33 ℃，发酵剂接种量5.13 %，得到沙蟹汁感官评分理论最大值为7.32。为了检验结果与实际情况是否一致，对这个结果进行验证，考虑到实际操作条件，确定最佳工艺参数为：发酵时间17 d，发酵温度26 ℃，发酵剂接种量5%，发酵初始pH值7.5，植物乳杆菌和鲁氏酵母菌混合比例3∶2。经过3次平行试验，得到感官评分为7.38±0.39，与理论预测值的相对误差为2.77%，这说明该模型能较好预测微生物复合发酵法改良沙蟹汁的生产工艺。

2.3 传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁风味比较

2.3.1 游离氨基酸含量

游离氨基酸是沙蟹汁鲜美滋味的主要来源，也是判断产品质量的重要标准之一。传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁中游离氨基酸含量如表5所示。传统沙蟹汁中游离氨基酸总量为2 244.12 mg/100 g，鲜甜味氨基酸含量为640.26 mg/100 g，占总量的19.08%。复合发酵沙蟹汁中游离氨基酸总量和鲜甜味氨基酸含量分别为2 605.77和783.68 mg/100 g，相比传统沙蟹汁，分别增加了16.12%和22.40%；在所有氨基酸中，精氨酸、天冬氨酸、组氨酸和赖氨酸含量较高，为1 503.11 mg/100 g，此4种氨基酸占游离氨基酸总量的57.69%，对复合发酵沙蟹汁的滋味形成有重要贡献。徐高丹等[20]报道发酵酱油中添加酵母菌，氨基酸的种类和含量会更加丰富，产品的感官评分和风味更好。李锐等[12]报道了克氏原螯虾头酱中添加复合发酵剂(木糖葡萄球菌、戊糖片球菌和鲁氏酵母菌)后，游离氨基酸含量明显增加，产品风味更加醇厚。综上，复合发酵沙蟹汁中鲜甜味氨基酸含量和游离氨基酸总量有显著高于传统沙蟹汁，产品滋味有较大的改善。

表5 传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁中游离氨基酸的含量 单位：mg/100 g

2.3.2 有机酸含量

传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁中有机酸含量的变化如表6所示。传统沙蟹汁中有机酸含量最高为乙酸(246.28 mg/100 g)，其次为乳酸(173.22 mg/100 g)、琥珀酸(112.05 mg/100 g)，含量最低为苹果酸(21.13 mg/100 g)。相比传统沙蟹汁，复合发酵沙蟹汁中有机酸总量为665.19 mg/100 g(增加了13.54%)，其中苹果酸、柠檬酸和乙酸含量分别降低了26.69%、14.28%和9.15%，而乳酸和琥珀酸含量显著增加，为221.27 mg/100 g(增加了27.74%)和176.24 mg/100 g(增加了57.28%)。琥珀酸和乳酸是水产品中对呈味有重要贡献的2种有机酸，特别是琥珀酸及其钠盐。琥珀酸具有清爽的酸味和鲜味，与鲜味氨基酸有协同作用，赋予产品可口的味觉和醇厚感[21]。有研究指出，丙酮酸脱水还原可形成琥珀酸，另外部分氨基酸在微生物作用下脱去氨基也可形成琥珀酸；部分乳酸可能来自于水产品本身，大多数则来自于发酵过程[22]。综上，与传统沙蟹汁相比，复合发酵沙蟹汁中乳酸和琥珀酸含量大幅度增加，对改善产品风味有重要贡献，它们共同赋予复合发酵沙蟹汁酸味、鲜味和发酵香味。

表6 传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁中有机酸的含量 单位：mg/100 g

2.3.3 呈味核苷酸含量

呈味核苷酸是沙蟹汁中重要的呈鲜物质，影响产品的口感和风味。这些核苷酸化合物中，肌苷酸(IMP)、鸟苷酸(GMP)、腺苷酸(AMP)因其阈值低且鲜味突出，是重要的呈鲜物质。IMP和GMP具有清爽的鲜味，在食品工业中有着广泛的应用[23-24]。AMP具有柔和的鲜味和甜味，能协调食物的整体滋味，压抑苦涩味并增强鲜味的醇厚感[25]。

传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁中呈味核苷酸的含量如表7所示。传统沙蟹汁中呈味核苷酸总量为213.28 mg/100 g，其中Hx含量最高，为56.86 mg/100 g，呈鲜味的5种核苷酸(IMP、GMP、AMP、ATP和ADP)含量为113.28 mg/100 g，占总量的52.89%。添加了复合发酵剂后，沙蟹汁中呈味核苷酸总量小幅度增加，为261.03 mg/100 g，呈鲜味的核苷酸中GMP、AMP和ATP含量无显著变化，IMP和ADP含量略有增加，而呈苦味的Hx含量增加了21.92%。

表7 传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁中呈味核苷酸的含量 单位：mg/100 g

从整体来看，呈味核苷酸对复合发酵沙蟹汁风味提升的贡献较小。

2.3.4 感官评分及氨基态氮和挥发性盐基氮的含量

据报道，传统沙蟹汁具有强烈的鲜味特点，其特征风味成分包括游离氨基酸、呈味核苷酸、有机酸、小分子肽等[1,3]。传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁的感官评分以及氨基态氮和TVB-N含量如图2所示。传统沙蟹汁的感官评分为6.29，其氨基态氮和TVB-N含量分别为(4.47±0.35)和(1.22±0.06) mg/mL。与传统沙蟹汁相比，复合发酵沙蟹汁整体色泽明亮、香气纯正，不仅能保留了原有的鲜美滋味，同时腥异味显著降低，其感官评分和氨基态氮含量分别增加17.31%和22.62%，挥发性盐基氮含量降低了28.69%。氨基态氮浓度与游离氨基酸、小分子肽等滋味成分的含量密切相关。据报道，植物乳杆菌和鲁氏酵母菌在发酵过程中可以将大分子蛋白转化为氨基酸、小分子肽等物质[26-28]，使得复合发酵沙蟹汁中鲜味物质含量增高，使得产品风味更佳醇厚怡人。TVB-N是反映产品的腐败程度和腥异味的重要指标，而酸性物质能一定程度上抑制腐败微生物生长从而降低TVB-N的生成[22]。根据有机酸的结果，复合发酵沙蟹汁中有机酸含量增加，可能对挥发性盐基态氮生成有抑制作用。

图2 传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁的感官评分以及氨基态氮和挥发性盐基氮含量 (mg/100 g)

3 结论

本研究首次采用微生物复合发酵法改良传统沙蟹汁的制备工艺，在传统工艺的基础上添加鲁氏酵母菌和植物乳杆菌进行发酵，植物乳杆菌和鲁氏酵母菌的最佳混合浓度比例为3∶2，通过单因素试验结合响应面法确定了最佳工艺条件：发酵初始pH值7.5，发酵时间17 d，发酵温度26 ℃，发酵剂接种量5%，在此条件下沙蟹汁感官评分为7.38。相比于传统沙蟹汁，复合发酵沙蟹汁的腥异味明显降低，产品色泽清亮、香气纯正、滋味醇厚，其感官评分、氨基态氮含量、游离氨基酸总量、鲜甜味氨基酸含量和有机酸总量有不同程度增加，同时TVB-N含量显著下降，这说明微生物复合发酵法能显著提高沙蟹汁的风味品质。本研究为沙蟹汁的规模化生产和风味改良提供理论基础，且对于沙蟹汁的市场推广具有重要的实际意义。