黄连解毒汤“异病同治”冠心病和2型糖尿病的网络药理学作用机制研究

范吉林，朱婷婷，田晓玲，薛振宇，任雯庆，郭经奇，张世亮

（1.山东中医药大学，山东 济南 2 50355；2.滨州医学院附属医院，山东滨州 3 71600；3.山东中医药大学附属医院，山东济南 2 50011）

冠心病（coronary heart disease，CHD）是由于冠状动脉出现粥样硬化，从而导致患者心脏出现缺血、缺氧、坏死等现象，严重影响患者的心功能［1］。2型糖尿病（typeⅡdiabetes，T 2DM）是一种以血糖升高为综合表现的代谢性疾病，其可以诱发心脏、血管等病变，是CHD病发的重要诱因之一［2］，冠心病合并2型糖尿病可致多种系统功能改变，病发心、脑、肾等组织器官功能衰退［3］。近年来，随着人们生活方式的改变和生活水平的提高，冠心病和糖尿病的患病率呈逐年上升的趋势。有研究指出，冠心病合并T 2DM患者预后情况较单纯冠心病预后患者差，并且T 2DM患者罹患冠心病的风险高于健康人群2～4倍［4］。由此可见，冠心病和T 2DM互为影响，同时加重各自疾病的发展［5］。因此在临床中及早发现和治疗能够有效预防和延缓冠心病合并糖尿病患者的寿命［6］。目前临床中多采用西药治疗，虽能有效缓解患者症状，但预后较差［7］；随着中医药的发展，中医药在治疗冠心病和T 2DM中疗效确切，并且能够有效改善患者的临床症状和预后情况。

黄连解毒汤出自葛洪《肘后备急方》，方名首见于《外台秘要》，具有泻火解毒的功效，用于治疗三焦火毒之证，主要由黄连、黄芩、黄柏和栀子等4味药组成，黄连入上焦而泻心火，黄芩、黄柏清泻中焦和下焦之火，栀子清泻三焦火热，黄连解毒汤是治疗三焦火盛的经典方剂［8］。研究证明，黄连解毒汤具有抗动脉粥样硬化、降糖、调脂、降压、改善胰岛素抵抗和保护内皮细胞等作用［9］，在临床中广泛应用于冠心病、高血压、糖尿病、高脂血症等疾病的治疗，不仅疗效确切，而且安全性较高［9］。黄连解毒汤虽在临床中广泛用用，但其作用机制尚不明确，本文运用网络药理学方法探究黄连解毒汤治疗冠心病合并T 2DM的作用机制，以期为黄连解毒汤在临床中应用提供理论依据。

网络药理学是一种基于“多成分-多靶点-多途径”的综合调控特征的中药机理研究方法，在中药机理研究中的应用已成为发展中药必不可少的方法［10］。这种用于探索“药物-成分-疾病-靶点”之间相互作用关系的方法与中医的整体观念相契合。网络药理学作为一种新的研究思路，可以用于解释中药复方的配伍规律及为中药寻找新的适应证［11］。本研究运用网络药理学的方法探讨黄连解毒汤“异病同治”冠心病和T 2DM的作用机制，为黄连解毒汤在临床中应用和进一步研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 黄连解毒汤药物活性成分筛选

借助中药系统药理学数据库平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）以方中药物黄连、黄芩、黄柏、栀子为关键词检索收集黄连解毒汤的活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥为标准进行筛选，并通过该数据预测得到黄连解毒汤的潜在作用靶点，然后将得到的潜在作用靶点导入Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库进行基因的标准化处理。

1.2 药物靶点获取

在OMIM（http：//www.omim.org/）和Gene-Cards（https：//www.genecards.org/）数据库以“coronary heart disease”“typeⅡdiabetes”为关键词进行检索，得到冠心病和T 2DM的潜在靶点

1.3 黄连解毒汤治疗冠心病与T 2DM靶点获取

运用Venn（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在线平台将化合物靶点与疾病靶点取交集，得到黄连解毒汤治疗冠心病和T 2DM的潜在作用靶点。

1.4 药物−成分−靶点−疾病网络图构建

将黄连解毒汤中单味药及活性成分，药物-疾病共同靶点导入Cytoscape3.7，2软件中，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图，利用“Network Analyzer”功能进行分析，其中节点代表药物、成分、疾病、靶点，边代表药物与成分、成分与靶点、靶点与疾病之间的相互作用关系。

1.5 PPI网络图及核心靶点筛选

将药物-疾病交集靶点导入至STING（http：//string-db.org）数据库，将物种限制为“人”（Homo sapiens），构建药物-疾病蛋白互作PPI网络图。将STING数据库分析得到的数据，以“tsv”格式导入至Cytoscape3.7.2软件中，根据度值大于平均值为条件筛选出核心靶点，并构建核心靶点网络图。

1.6 GO生物过程与KEGG通路富集分析

将得到的药物-疾病交集靶点导入至DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库平台，选择“OFFICE_GENE_SYMBOL”，将物种限定为“人”（Homo sapiens），以P≤0.05为条件筛选得到黄连解毒汤治疗冠心病合糖尿病的生物过程；以P≤0.05筛选得到黄连解毒汤治疗冠心病合糖尿病的相关通路，选取前20条绘制表格。

2 结果

2.1 黄连解毒汤活性成分筛选

以OB≥30%，DL≥0.18为筛选标准，在TCMSP共检索得到黄连解毒汤活性成分103个，其中黄芩36个，黄连14个，黄柏38个，栀子15个，删除重复项最终得到黄连解毒汤活性成分86个，并通过该数据库得到药物潜在作用靶点140个。见表1。

表1 黄连解毒汤活性成分筛选Tab 1 Active components of Huanglian Jiedu Decoction

2.2 药物与疾病交集靶点Venn图

通过OMIM和GeneCards数据库共检索得到冠心病相关靶点5 342个、T 2DM相关靶点114个，运用Venn图将黄连解毒汤活性成分预测靶点与冠心病和T 2DM疾病靶点取交集，得到黄连解毒汤治疗冠心病和糖尿病的14个靶点。见图1。

图1 黄连解毒汤治疗冠心病和T 2DM的靶点Venn图Fig 1 Venn diagram of Huanglian Jiedu Decoction in tr eating cor onar y hear t disease and T 2DM

2.3 药物-成分-疾病-靶点网络图构建

利用Cytoscape3.7.2软件构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图，其中网络中共有91个节点（其中黄连解毒汤1个，疾病2个，靶点14个，活性化合物74个），黄色代表黄芩活性成分，绿色代表黄柏活性成分，粉色代表黄连活性成分，红色代表栀子活性成分，蓝色代表药物-疾病交集靶点，“六边形”代表黄连解毒汤，“矩形”代表疾病冠心病和T 2DM。其中槲皮素（MOL 000098）、β-谷甾醇（MOL 000358）、豆甾醇（MOL000449）、黄连素（MOL001454）、小檗碱（MOL 002894）、Worenine（MOL 002668）等活性成分节点的度值较高，提示这些活性化合物在黄连解毒汤治疗冠心病和T 2DM中发挥重要作用。见图2。

图2 药物-成分-疾病-靶点网络图Fig 2 Network diagram of medicine-ingredient-disease-target

2.4 PPI网络图构建及核心靶点网络图构建

将药物-疾病相映射得到的14个靶点导入STING在线平台进行蛋白互作（PPI）网络分析，图中共包括14个节点，45条边，平均节点度为6.43，节点代表靶点蛋白，边代表蛋白与蛋白之间的相互作用关系，见图3。将STING数据库得到的文件以“tsv”格式导入至Cytoscape3.7.2软件中，以Degree值大于6为筛选标准，筛选得到药物-疾病核心靶点网络图，其中白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、趋化因子2（CCL 2）、血管内皮生长因子A（VEGFA）节点的度值分别为12、11、9、10，说明这些靶点是黄连解毒汤治疗冠心病和T 2DM的核心靶点，见图4。

图3 黄连解毒汤与冠心病和T 2DM蛋白互作分析图Fig 3 Proteins interaction between Huanglian Jiedu Decoction and coronary heart disease and T2DM

图4 药物-疾病核心靶点网络图Fig 4 Network diagram of core target of drug-disease

2.5 GO功能结果分析

将上述得到的14个交集靶点导入至DAVID在线数据库平台进行GO功能富集分析，得到生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）条目98个，以P≤0.05为筛选条件，分别选取前10条绘制成气泡图，主要涉及基因表达的正调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、胞外空间、细胞因子活性、类固醇激素受体活性等生物过程。见图5～7。

图5 GO生物过程分析Fig 5 GO biological process analysis

2.6 KEGG通路富集分析结果

KEGG通路富集分析发现14个交集靶点主要富集在20条信号通路上（P≤0.05），见表2，其中涉及疟疾、癌症信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路、NOD样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、胰岛素抵抗等通路，其中HIF-1信号通路、TNF信号通路、NOD样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路与冠心病和T 2DM关系密切，提示黄连解毒汤可能通过以上通路参与治疗冠心病T 2DM。

表2 KEGG通路信息表Tab 2 KEGG pathway results

图6 GO细胞组分分析Fig 6 GO Cell components analysis

图7 GO分子功能分析Fig 7 GO M olecular function analysis

3 讨论

冠心病归属于中医“胸痹”范畴，其病机多为本虚标实，多由于气滞、血瘀、痰凝等病理产物导致热毒内蕴、灼伤脉络，致络脉拘挛不同［9］；T 2DM属于“消渴病”范畴，病机多为阴虚为本，燥热为标，多由于饮食炙煿厚味，致脾胃蕴化失常，蕴积化热，湿热蕴结化火，火热易蕴结生毒，热毒易伤机体之气阴［12］；二者病理基础具有相似之处，多由于“热毒”致病，可以概括为“热毒炽盛”［12］，因此，临床中治疗应以“清热解毒”为主。黄连解毒汤作为清热解毒的经典方剂，在临床中广泛应用于T 2DM、冠心病、老年性痴呆、颈动脉斑块、缺血性中风等疾病的治疗［13］。路春茹［14］将100例T 2DM合冠心病患者随机分为观察组和对照组，对照组采用常规西药治疗，观察组以黄连解毒汤治疗，治疗结果显示黄连解毒汤具有良好的效果，不仅可以降低患者的血糖水平，而且还可以改变冠心病患者的临床症状。进一步证实黄连解毒汤“异病同治”冠心病和T 2DM的具有良好的临床疗效，但由于其成分较复杂，作用机制尚不明确，因此，本研究运用网络药理学方法探讨黄连解毒汤“异病同治”冠心病和T 2DM的作用机制，为黄连解毒汤在临床中应用提供理论依据。

本研究采用网络药理学的方法共筛选出黄连解毒汤活性成分103个和相对应靶点140个。其中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、黄连素、小檗碱等活性成分作用最强。研究证明，槲皮素具有抗动脉粥样硬化、改善心功能、降血脂、抗血栓、抑制心肌肥厚等作用，并且还具有降血糖、减轻胰岛素抵抗的作用［15］。小檗碱能够通过下调p38MAPK介导的NF-κB信号通路来降低炎性细胞因子的表达抑制心肌细胞凋亡［16］；小檗碱具有抗糖尿病作用，能够可通过调节PI3K/AKT/FOXO1/Bim信号通路改善高糖诱导的足细胞损伤［17］。β-谷甾醇是黄连、黄柏、栀子三味药共有的活性成分，具有抗动脉硬化、抗炎、抗氧化、抗高血脂、抗癌、抑制血小板聚集等作用［18］，还可以通过增加脂肪组织中胰岛素受体和葡萄糖转运蛋白4的激活来增强血糖控制［19］。以上说明黄连解毒汤治疗冠心病和T 2DM具有多成分的特点。

黄连解毒汤治疗冠心病与T 2DM涉及多靶点，通过药物-疾病核心靶点网络图筛选，得到IL 6、TNF、CCL2、VEGFA、AR等9个核心靶点。脂肪组织分泌的炎性细胞因子，例如IL 6和TNF，可能发挥内分泌作用，通过干扰胰岛素信号传导途径来促进胰岛素抵抗，从而导致胰岛素抵抗的临床表现［20］；TNF及IL-6炎性因子在血管内皮细胞的过度表达，能够能加血管内皮平滑肌细胞的数量，使血管内皮增厚，促进动脉粥样硬化［21］，因此抑制炎症因子的激活能够改善胰岛素抵抗和延缓动脉粥样硬化的发展。血管内皮生长因子（VEGF）包含4个成 员，包 括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D［22］，通常所说的VEGF指的是VEGF-A，VEGF-A能够特异性地作用于血管内皮细胞，具有促进血管内皮细胞增殖和迁移、抑制内皮细胞凋亡、促进血管新生及维持血管、改善胰岛素抵抗等作用［23］，在冠心病、炎症性病变、糖尿病组织再生等病理生理过程中发挥了重要作用［24］。进一步证实黄连解毒汤是通过多成分、多靶点治疗冠心病和T 2DM。

黄连解毒汤“异病同治”冠心病和T 2DM的靶点GO生物过程涉及基因表达的正调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、胞外空间、细胞因子活性、类固醇激素受体活性等生物过程，这些生物在黄连解毒汤治疗冠心病和T 2DM中起关键作用。通过KEGG通路富集分析发现，靶点主要富集在疟疾、癌症信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路、NOD样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、胰岛素抵抗等信号通路。HIF-1由亚基HIF-α和组成性亚基HIF-β组成的异二聚体结构［25］，HIF-1信号通路在生物发育、代谢、贫血、损伤等病理生理过程发挥重要作用［26］，缺氧诱导因子1α（HIF-1α）是缺氧性损伤中发挥重要的核转录因子，其下游靶基因涉及血管控制、血管新生、红细胞生成、细胞增殖和存活等过程［27］，能够减轻缺氧诱导的心肌细胞损伤；HIF-1α能够调控下游功能基因的表达水平，介导器官和组织对微循环缺氧的应答，从而参与糖尿病并发症的发生发展［28］。研究表明［29］，PI3K-Akt信号通路的激活参与心肌细胞凋亡的调节；也有研究证明，PI3K/AKT信号通路参与了许多细胞进程的调控，包括细胞生长、转录、翻译、细胞增殖及糖代谢等过程，其信号分子异常可以引起冠心病、糖尿病及癌症等疾病［30］。苏莉等［31］通过动物实验发现可以通过抑制PI3K/AKT信号活性对动脉粥样硬化小鼠具有保护作用。PI3K/Akt信号通路同时也是胰岛素信号转导中重要通路之一，正常生理情况下，与受体结合后可以维持血糖平衡和脂类代谢［32］，胰岛素分泌不足时，PI3K/Akt信号通路受到抑制，会促使胰岛素抵抗，进一步导致糖尿病的发生［33］，因此激活PI3K/Akt信号通路可能有效缓解血糖、血脂和胰岛素抵抗。提示PI3K/Akt信号通路可以双向调控冠心病和糖尿病的发生和发展。TNF信号通路可促使炎性细胞因子和TNF-α本身等基因的表达诱导细胞凋亡［34］，TNF-α与胰岛素抵抗有密切关系，机制可能与TNF-α通过激活NF-κB信号通路，抑制胰岛素信号传导有关［35］。以上说明黄连解毒汤“异病同治”冠心病和T 2DM的通路不是单一的，可以通过多通路、多途径治疗冠心病和T 2DM。

“异病同治”作为中医基础理论重要的指导原则，至今仍在临床中广泛应用，但作用机制尚不明确［36］。网络药理学作为一种新的研究策略和方法，为中药复方“异病同治”的作用机制提供了新的思路。本研究运用网络药理学方法发现冠心病和T 2DM的共有信号通路与炎症反应和糖脂代谢密切相关，这与目前冠心病与T 2DM的机制具有一致性。进一步证实黄连解毒汤治疗冠心病和T 2DM具有多成分、多靶点、多途径的特点，为后续实验验证黄连解毒汤治疗冠心病和T 2DM的关键靶点和信号通路提供了理论基础和理论依据。