基于网络药理学分析丹参在骨关节炎中的作用机制

袁长深，容伟明，卢智贤，梅其杰，郭锦荣，段 戡

（1.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 5 30023；2.广西中医药大学，广西 南宁 5 30000）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种伴随结构改变的关节疼痛综合征，是最常见的关节疾病。随着OA发病率升高［1］，关节疼痛和残疾问题较为突出，这不仅影响患者的生活质量，而且对全球医疗体系造成实质性的负担。然而，目前使用止痛疗法效果不佳，具有明显的副作用，尚缺乏有效的缓解OA病情的药物［2］。近年来，通过研究OA的发病机制来提高药物治疗的效果，是医学领域的一个热点［3］。

丹参具有活血调经、凉血消痈、安神的功效。丹参作为活血化瘀之要药，常用于治疗OA，但其化学成分较多，治疗OA的分子机制亦不明确。因此，本文采用网络药理学方法，分析丹参有效成分治疗OA的潜在机制，为后期的研发与治疗OA提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 丹参有效成分及作用靶点

TCMSP是独特的中草药系统药理平台，它由在中国药典中注册的所有499味中草药组成，包含29 384个成分、3 311个靶标和837种相关疾病，针对每个化合物成分提供了较为全面的人体吸收、分布、代谢、排泄（ADME）过程的评估数据，通过此数据库可获取药物、靶标和疾病之间的关系。通过TCMSP数据库（http：//Tcmspw.com/tcmsp.php）检索“丹参”，并下载满足条件“口服生物利用度OB（%）＞30”、“类药性DL＞0.18”的有效成分，同时查找有效成分的作用靶点。

1.2 疾病相关基因的筛选

GeneCards是人类基因综合数据库，可提供简明基因组、蛋白质组、遗传和功能上已知和预测的人类基因。利用GeneCards数据库（http：//www.Genecards.org/）、人类孟德尔遗传病OMIM数据库（https：//www.omim.org/）筛选“OA”基因，以获得相对完善的基因数据。

1.3 筛选靶基因

使用R语言软件“VennDiagram”包，将OA相关基因和丹参作用靶点相交集，获得丹参作用于OA的靶基因，并做出韦恩图。

1.4 丹参有效成分与靶基因的关系

通过自编程的Perl脚本选出与靶基因相关的有效成分；利用Cytoscape软件构建丹参有效成分与OA靶基因关系图；采用“cytoHubba”插件对网络进行拓扑学分析，选出节点的度（Degree）最多的前十个有效成分。

1.5 关键基因的PPI网络

String数据库是一个可以检索已知蛋白质之间和预测蛋白质之间相互作用的数据库，为了更好地了解靶基因表达蛋白之间的关系，使用String数据库在满足综合得分≥0.4的条件下建立PPI网络。再利用R语言软件根据节点之间的关系程度选出PPI网络中前30位靶基因，以更好地了解丹参通过靶基因作用治疗OA。

1.6 GO批注和KEGG途径富集分析

采用基因本体论（GO）和途径富集来分析靶基因，可揭示其所参与的细胞成分、分子功能、生物过程及信号通路，便于理解中药有效成分作用于疾病的潜在机制。Bioconductor是一个基于R语言的、面向基因组信息分析的应用软件集合，可针对DNA微阵列或基因芯片数据处理、分析、注释等。利用Bioconductor中 的“clusterProfiler”、“DOSE”和“pathview”三个包对靶基因进行GO和KEGG富集分析，GO分析包括3类：生物过程（BP），细胞成分（CC）和分子功能（MF）。

2 结果

2.1 丹参的有效成分及其作用靶点

在TCMSP数据库中，筛选出丹参的65个有效成分，获得2 566个作用靶点，通过自编程的Perl脚本将作用靶点转换为基因文本，获得108个有效、独立的靶基因。

2.2 疾病相关基因及靶基因

通过GeneCards和OMIM两个数据库共获得2 613个与OA相关、独立有效的基因。利用R语言软件“VennDiagram”包将2 613个与OA相关基因与108个丹参作用的靶点做交集，共获得65个靶基因，即为丹参治疗OA的靶基因。见图1。

图1 OA相关基因与丹参作用靶点的交集Fig 1 The intersection of OA-related genes and the target of Danshen

2.3 有效成分与靶基因的关系网络图

利用Perl软件从丹参的65个有效成分中筛选出可直接作用于靶基因的57个有效成分，通过cytoscape3.6.1软件构建有效成分-靶基因关系网络图，浅蓝色八边形代表OA疾病，与之相连接的绿色圆形代表65个靶基因，紫色正方形代表丹参，与之相连接的橙色倒三角代表57个有效成分，见图2。最后，通过拓扑学分析发现木犀草素、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参内酯等10个有效成分发挥主要作用，见表1。

图2 丹参作用于OA的有效成分-靶基因的关系Fig 2 The relationship between the effective ingredients of Danshen on OA and target genes

表1 关系网络中有效成分节点的拓扑学分析Tab 1 Topological analysis of effective component nodes in relational network

2.4 靶基因的PPI网络

采用String数据库建立靶基因的PPI互作网络图，使用R语言软件筛选出IL-6、AKT 1、VEGFA、EGFR、STAT 3、MAPK 1、MYC等30个重要的靶基因，即为丹参治疗OA的重要作用靶点，见图3、4。

图3 靶基因的PPI互作网络Fig 3 PPI interaction network of target genes

图4 关系较为密切的前30靶基因Fig 4 Top 30 closely r elated tar get genes

2.5 GO和KEGG富集分析

通过Bioconductor对靶基因进行GO和KEGG富集分析，发现靶基因的GO主要涉及细胞因子受体结合、DNA结合转录激活因子活性、RNA聚合酶II特异等，见图5；KEGG信号通路主要富集在PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹 病 毒 感 染 等，见 图6；通 路 中PI3K-Akt、IL-17、JAK-STAT、MAPK及NF-kappa B等信号通路较为重要，见表2。

表2 靶基因的重要通路Tab 2 Important pathways of target genes

图5 GO富集分析Fig 5 Go enrichment analysis

图6 KEGG富集分析Fig 6 KEGG enrichment analysis

3 讨论

OA是一种伴随结构变化的关节疼痛综合征，轻则关节疼痛，重则导致关节畸形［4，5］。目前OA发病机制不明确，尚无有效阻止该病进程的手段或方法，OA诊疗指南（2018版）主张个性化、阶梯化治疗［6］。药物治疗常使用止痛药治疗OA，但其副作用多［2］，因而在OA诊疗指南（2018版）中推荐可使用中成药治疗，并认为中药可通过多种途径减轻OA疼痛，延缓发病进程［6］，因而明确中药作用OA机制，对筛选或开发中成药制剂就显得尤为重要。

OA属于中医“骨痹、膝痹、鹤膝风”等范畴，本病病机虽属“本虚标实”，但田雨教授认为OA早期即有瘀，瘀在痹前。当代医家兰健教授认为瘀血是OA的病理产物，亦是OA产生的关键，OA治疗必先祛瘀。张志芳等［7］认为痹证多瘀血，瘀贯穿OA疾病始终，治疗先活血化瘀止痛，后辨证论治求本，亦符合中医“通则不痛”、“急则治其标”原则。

丹参作为活血化瘀之要药，常用于治疗OA。丹参不仅可通过抗氧化应激作用来预防OA软骨退变［8］，而且可减轻OA软骨损伤，达到治疗OA的目的。丹参有效成分-靶基因的关系网络显示丹参治疗OA通过多成分、多途径、多靶点发挥作用［9，10］，这可能与丹参中含有木犀草素、丹参酮ⅡA和隐丹参酮等多种有效成分密切相关；同时，OA涉及靶基因结果也显示对OA治疗也存在多靶点。因此，通过网络药理学明确丹参有效成分作用OA的靶基因、途径就显得尤为重要。

通过将丹参有效成分作用靶点与OA相关基因合并，共筛选出靶基因65个，再利用String数据库建立靶基因的PPI互作网络图，获得IL-6、AKT1、VEGFA、EGFR、STAT3、MAPK 1、MYC等重要靶基因，这些基因可能是丹参治疗OA的关键作用靶点。基因GO功能分析显示，这些靶基因主要涉及细胞因子受体结合、DNA结合转录激活因子活性、RNA聚合酶II特异等。细胞因子包括白介素、趋化因子以及其他信号分子，可通过与细胞表面受体结合以激活信号传导并调节多方面的生物学作用［11］，例如细胞因子IL-1与受体IL-1R1结合，可诱导丝裂原活化蛋白激酶（MAP）激酶磷酸化进一步激活调节 激 酶（ERK）、蛋 白38（p38）和c-Jun N端 激 酶（JNK），导致软骨细胞中MMP基因表达增加，Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖基质成分合成减少，表明细胞因子在软骨合成与降解中起重要作用［12］。在真核细胞中，转录因子与RNA聚合酶Ⅱ可形成转录起始复合体，共同参与转录起始过程，从而对基因表达起抑制或增强作用。

OA发生、发展与信号通路密切相关。靶基因富集分析结果也显示，KEGG通路主要涉及PI3K-Akt、IL-17、JAK-STAT、MAPK及NF-kappa B等重要信号通路。PI3K-Akt作为重要的抗凋亡通路，PI3K的激活可使Akt磷酸化并激活［13］，进而使TSC1、TSC2二聚体解聚，解除其对Rheb的抑制作用，激活mTOR及下游转录因子eIF4E，影响凋亡相关基因表达［14］；同时，PI3K-AKT作为调节自噬的经典信号传导通路，可激活细胞自噬来改善膝关节软骨损伤。IL-17是关键炎症细胞因子，在组织炎症和自身免疫性疾病中起关键作用［15］，可激活软骨细胞合成MMP-1和MMP-13胶原酶来加速软骨分解；亦可通过胶原碎片和软骨蛋白多糖的分泌来增强基质降解作用，因而有效阻断IL-17信号通路可以预防及治疗OA［16］。JAK-STAT通路始于细胞因子刺激JAK激酶，活化的JAK激酶使胞质中的STAT磷酸化，2个磷酸化的STAT在核内与靶基因启动子中特异DNA序列结合，调节细胞增殖、分化、凋亡等［17］。丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路包括ERK1/2、JNK和p38 MAPK，参与细胞分化、增殖、凋亡等［18］；在细胞因子作用下，ERK 1/2、p38和JNK MAPK磷酸化，引发炎症或凋亡相关基因的表达，抑制软骨细胞增殖，触发软骨细胞凋亡，加重关节软骨损害［19］。而NF-kappa B作为一个经典的激活因子，由两个Rel蛋白单体组成的二聚物转录因子，可迅速激活NF-kappaB途径引起基质金属蛋白酶（MMPs）增加，导致软骨分解；同时通过调控凋亡相关基因的表达调节细胞生长与凋亡［20，21］。

采用网络药理学方法分析丹参对OA的作用机制，为研究丹参有效成分对OA的作用提供理论依据。然而，本文仅是利用在线数据库筛选丹参有效成分作用于OA的靶基因、通路，但仍需通过实验研究加以验证。