复方荆芥颗粒的抗炎、镇痛、祛痰作用以及急性毒性实验研究

李 萍,安文艺,张译方,毕小平*

(1山西医科大学药学院药剂综合实验室,太原 030001;2山西省侯马市安益生中医研究院;*通讯作者,E-mail:bixping@163.com)

慢性咽炎为上呼吸道慢性炎症的一部分,临床表现以咽部干、痒、痛及灼热、异物感较为多见[1,2]。其发病原因及可能的诱因有:病原微生物的感染,不健康的生活习惯,空气质量下降等[3-5]。据统计,慢性咽炎的发病率占咽喉部疾病的10%-12%[6],发病率较高,且多呈现迁延难愈的特点。目前西医治疗慢性咽炎主要根据其感染的致病菌使用抗生素类药物,因此会产生耐药性及不良反应等问题。而中医药治疗则具有疗效确切、不良反应小、复发率低等优势[7]。

复方荆芥颗粒的源处方是应用于临床多年的经验方,具有疏风清热,利咽消肿,宣肺散结,祛风止痛,理气健脾,燥湿化痰的功效,在慢性咽炎的治疗方面疗效确切。但汤剂诸多不便,本实验室将其制备成颗粒剂,拟通过小鼠急性毒性实验对该颗粒的安全性进行初步评价,进而依据该验方的功能主治进行二甲苯致小鼠耳肿胀实验、醋酸扭体实验、气管酚红排泌实验,研究该颗粒的抗炎、镇痛、祛痰之功效,并初步探究该颗粒的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试药

UV-1800PC紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);KQ-50DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);XS205电子天平(梅特勒-托利多集团)。

复方荆芥颗粒(实验室自制,批号20200908,20200909,20200910);复方金银花颗粒(黑龙江乌苏里江制药有限公司,批号20200129);生理盐水注射液(石家庄四药有限公司,批号2007242007);二甲苯(天津市风船化学试剂科技有限公司,批号20190103);酚红(天津市风船化学试剂科技有限公司,批号20190908);醋酸(天津市天力化学试剂有限公司,批号20110228);维生素C(天津市大茂化学试剂厂，批号20160103)。

1.2 实验动物

健康ICR小鼠,雄性,体质量(20±2)g;山西医科大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(晋)2015-0001。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及给药方式 取ICR小鼠40只,随机分为高、中、低剂量组,阳性对照组和空白对照组,每组8只。根据《药理实验方法学》[8],以成人剂量的10倍、5倍、1倍给以复方荆芥颗粒水溶液,作为高、中、低剂量组,分别为0.8,0.4,0.08 g/d;阳性对照组给以复方金银花颗粒,以0.8 g/d的剂量给药;空白对照组给以同等体积的蒸馏水。给药体积均为每10 g体质量灌胃给药0.2 ml,24 h内给药2次,连续给药7 d,末次给药前禁食不禁水。

1.3.2 耳肿胀实验 取ICR小鼠40只,按“1.3.1”项下方法进行分组及给药,给药45 min后,取20 μl二甲苯均匀涂布于小鼠右耳正反两面,30 min后颈椎脱臼处死小鼠,用6 mm直径打孔器将小鼠双耳同部位切下,称定各耳廓重量。并按以下公式计算肿胀率(%)和肿胀抑制率(%)[9],并以此评价复方荆芥颗粒的抗炎作用:肿胀率=[(右耳廓重-左耳廓重)/左耳廓重]×100%;肿胀抑制率=[(空白对照组肿胀率-给药组肿胀率)/空白对照组肿胀率]×100%。

1.3.3 醋酸扭体实验 取ICR小鼠40只,按“1.3.1”项下方法进行分组及给药,给药45 min后,腹腔注射0.6%醋酸溶液10 ml/kg,记录注射后20-45 min内小鼠腹部内凹,伸展后肢,臀部抬高的次数,按照下式计算镇痛百分率(%)[10],并以此评价颗粒的镇痛作用：镇痛百分率=[(空白对照组扭体次数-给药组扭体次数)/空白对照组扭体次数]×100%。

1.3.4 气管酚红排泌实验 取ICR小鼠40只,按“1.3.1”项下方法进行分组及给药,给药30 min后,腹腔注射1%酚红溶液20 ml/kg,30 min后颈椎脱臼处死小鼠,剪开其颈部皮肤,分离自甲状软骨至气管分支处的一段气管,置于3 ml生理盐水中,加入0.1 mol/L的NaOH溶液1 ml,超声20 min显色后,在546 nm处测定其吸光度值[11],以酚红标准曲线y=0.379x+0.004(r=0.998 4),计算酚红浓度及酚红排泌量,按照下式计算祛痰百分率(%),并以此评价颗粒的祛痰作用：祛痰百分率=[(给药组排泌量-空白对照组排泌量)/空白对照组排泌量]×100%。

1.4 小鼠急性毒性实验方法

取20只ICR小鼠,随机分为复方荆芥颗粒与空白对照组,每组10只。实验前,禁食过夜,自由饮水。以最大剂量每10 g体质量给0.2 ml颗粒水溶液,24 h内给药3次,合并作为1次剂量计算。记录14 d内各组小鼠体质量变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物等。于观察期满后,颈椎脱臼处死小鼠并进行解剖,按照下式计算小鼠各脏器指数(%)[12]:脏器指数=各脏器湿重/小鼠体重×100%。

1.5 羟基自由基清除率的测定方法

1.5.1 溶液的配制 供试品溶液:称取复方荆芥颗粒0.1 g,溶于10 ml蒸馏水中,滤过,稀释10倍即得1 mg/ml的供试品溶液。

维生素C溶液:称取维生素C约0.01 g,精密称定,用蒸馏水溶解并定容至100 ml,得0.1 mg/ml维生素C溶液,临用新制。

1.5.2 羟基自由基清除率的测定 取0.15 mmol/ml的亚甲蓝溶液1 ml,于具塞刻度试管中,依次加入9 mmol/L FeSO4溶液55 μl,加入供试品溶液或维生素C溶液50 μl,混匀后,加入10 mmol/L H2O2溶液55 μl,涡旋反应1 min,加入蒸馏水定容至10 ml,摇匀,于656 nm处测定吸光度值A1;以同体积蒸馏水代替样品溶液,同法操作后,作为空白对照,于656 nm处测定吸光度值A2;以等浓度亚甲蓝吸光度值为A0。根据以下公式计算自由基清除率S(%)[13]:S=(A1-A2)/(A0-A2)×100%。

1.6 统计学分析

2 实验结果

2.1 耳肿胀实验结果

由二甲苯致小鼠耳肿胀实验可知,高、中、低剂量复方荆芥颗粒在炎症抑制作用中存在明显的剂量依赖关系,剂量越高,小鼠耳肿胀率越低,表明抗炎作用越强。与空白对照组比较,高、中剂量组小鼠耳廓肿胀率显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05,见表1)。且由肿胀抑制率可知,高、中剂量组与阳性对照组之间差异无统计学意义(见表1),表明高、中剂量对二甲苯导致的炎症均有明显的抑制作用。

表1 小鼠耳肿胀实验结果

2.2 醋酸扭体实验结果

由醋酸扭体实验可知,高、中、低剂量复方荆芥颗粒在镇痛作用中存在明显的剂量依赖关系,剂量越高,扭体次数越少,表明镇痛作用越强。与空白对照组比较,高、中剂量组小鼠扭体次数有显著降低(P<0.01,见表2);且高剂量组与阳性对照组之间镇痛百分率差异无统计学意义,表明复方荆芥颗粒对醋酸所致的疼痛有明显的抑制作用。

表2 醋酸扭体实验结果

2.3 气管酚红排泌实验结果

由气管酚红排泌实验可知,高、中、低剂量组在祛痰作用中存在明显的剂量依赖关系,剂量越高,酚红排泌量越高,表明祛痰作用越强。与空白对照组比较,高、中、低剂量组小鼠排泌量显著增加(P<0.01,见表3),且高、中剂量组与阳性对照组之间祛痰百分率差异无统计学意义,表明复方荆芥颗粒具有祛痰作用。

表3 气管酚红排泌实验结果

2.4 小鼠急性毒性实验结果

观察期内,复方荆芥颗粒组小鼠的外观、饮食、行为活动、分泌物、排泄物等均正常,各组均未出现死亡情况,体质量增长率与空白对照组小鼠差异无统计学意义(P>0.05,见表4)。观察期满后,对小鼠进行大体解剖,并称定心、肝、脾、肺、肾各组织的重量。结果表明,给药组与空白对照组小鼠的各脏器指数均差异无统计学意义(P>0.05,见表5)。可初步判断复方荆芥颗粒安全无毒。

表4 急性毒性实验小鼠存活情况及体质量增长率

表5 急性毒性实验小鼠各脏器指数

2.5 羟基自由基清除率测定结果

3批次自制复方荆芥颗粒的羟基自由基清除率测定结果显示,0.5 mg颗粒的平均清除率为71.5%,与0.4 mg维生素C的抗氧化活性(72.2%)相当(见表6),表明颗粒具有较强的抗氧化活性。

表6 羟基自由基清除率测定结果

3 讨论

本研究表明,复方荆芥颗粒具有抗炎、镇痛作用,可能是与其抗氧化活性有关。复方荆芥颗粒中含有的主要活性物质包括挥发油、黄酮类化合物、多糖类化合物等。这些活性物质均具有抗氧化活性[14-16],也是抗炎、镇痛的物质基础。本颗粒剂可能是通过抗氧化作用,抑制活性氧激活促炎性转录因子的转录活性,从而抑制过量炎症因子(如IL-6、TNF-α等)的产生[17,18],达到抗炎的目的。进而抑制因子TNF-α和IL-6导致的神经病理性疼痛[19]。当然,他们也可能是通过下调促炎因子的释放,减轻炎性细胞浸润,从而抑制炎症反应[20-22];抑或是通过介导炎症性疼痛氧化失衡而产生的痛行为来抑制疼痛[23,24],以及利用挥发油的中枢镇痛活性来减轻小鼠的痛感[25]。故而,本文的研究结果为进一步深入探究复方荆芥颗粒抗炎、镇痛作用的机制奠定了基础。究竟该颗粒剂通过什么途径发挥抗炎、镇痛作用,以及祛痰作用机制如何,还有待于进一步深入研究。

综上,复方荆芥颗粒安全无毒,具有抗炎、镇痛、祛痰的作用,可为临床治疗慢性咽炎提供科学依据,具有一定的实际应用价值。