HPLC同时检测参精止渴丸中葛根素、五味子醇甲和大黄素成分的研究

杨 丹,姜 鸿,赵 玥,辛旭阳,赵 岩

(1辽宁中医药大学附属第二医院制剂室,沈阳 110034;2辽宁中医药大学附属第二医院药学分析室;*通讯作者,E-mail:zzq2021@126.com)

参精止渴丸是由葛根、大黄、五味子、红参、黄芪、黄精、茯苓、白术、黄连、甘草等10味药材,经粉碎、过筛、混合、制丸、干燥等工艺制备而成的中药成方制剂,其具有益气养阴、生津止渴等功效,常用于治疗气阴两亏、内热津伤所致的消渴,病症见少气乏力、口干多饮、易饥、形体消瘦等,为II型糖尿病患者常用药物[1]。据统计,2019年全世界约有4.63亿糖尿病患者,预计到2045年患者将达到约7亿人次,其中亚洲国家,尤其我国是糖尿病患者重灾区,2019年度中国糖尿病患者约1.22亿人次,居全球首位[2-4];随着我国经济社会的发展,人们生活水平的日益提高,预计2028年我国糖尿病患者数量将超过1.49亿人,参精止渴丸作为临床治疗Ⅱ型糖尿病的有效药物,收载于《中国药典》2015年版一部,仅通过检测葛根素含量作为含量控制指标[1],不能较好地指示该产品的质量水平,针对该产品中主要起功能作用的药材葛根、五味子和大黄,控制好这3种药材有效成分的含量,可以更好地控制该产品的疗效,本文研究开发中药制剂参精止渴丸中葛根素、五味子醇甲和大黄素成分同时检测的HPLC方法。

1 材料与方法

1.1 材料

安捷伦1260 infinity型HPLC仪;幻芾聿Synergy型超纯水仪;梅特勒AB204-S型电子天平;HB-8000型超声波清洗器。

参精止渴丸(辽宁中医学院药业有限公司生产,规格:每100丸7 g,批号分别为:191212,200113,200421);葛根素对照品(批号:110752-201816,含量以95.4%计),五味子醇甲对照品(批号:110857-201815,含量以99.7%计),大黄素对照品(批号:110756-201913,含量以96.0%计),均购自中国食品药品检定研究院;甲醇、乙腈:HPLC级(美国MERCK公司),磷酸等其他试剂:优级纯(上海化学试剂厂),水为纯水仪制备水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱:Waters X-bridge ODS C18型色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速为1.0 ml/min,柱温设定28 ℃,进样体积为10 μl,检测波长为252 nm,流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱(见表1)。

表1 色谱洗脱程序

1.2.2 混合对照品溶液的制备 取葛根素、五味子醇甲和大黄素对照品,分别精密称定76.3,299.1,76.8 mg,分别置100 ml容量瓶中,加95%甲醇溶解并稀释至刻度,再分别取上述储备溶液各1.0 ml,置10 ml容量瓶中,加95%甲醇制成每1 ml溶液中分别含葛根素76.3 μg、五味子醇甲299.1 μg、大黄素76.8 μg的对照品混合储备溶液;再分别精密量取上述对照品储备溶液各1.0 ml,置10 ml容量瓶中,加95%甲醇定容至刻度,即得。

1.2.3 供试品溶液 取参精止渴丸样品,将内容物置研钵中研细,取约1.0 g,精密称定,置50 ml容量瓶中,加95%甲醇35 ml,超声提取25 min(超声频率80 kHz,功率200 W),放冷,加95%甲醇定容至刻度,摇匀,0.45 μm滤膜滤过,取续滤液,作为供试品溶液。

1.2.4 阴性供试品溶液 按参精止渴丸加工方法和药材配比分别制备缺葛根、五味子和大黄素的阴性供试品,阴性供试品按2.3供试品溶液制备方法处理,分别制备阴性供试品溶液。

2 结果

2.1 系统适应性试验

取1.2.2混合对照品溶液和1.2.3供试品溶液,按1.2.1色谱条件分别进样10 μl,采集色谱图。葛根素、五味子醇甲和大黄素均能达到基线分离,且各色谱峰之间分离度均大于1.5,以葛根素色谱峰计算理论塔板数大于5 000。结果表明色谱系统适应性良好。

2.2 专属性试验

分别取1.2.2混合对照品溶液、1.2.3供试品溶液和1.2.4阴性供试品溶液,按1.2.1色谱条件分别进样10 μl,采集色谱图。对照品溶液与供试品溶液中3种成分色谱峰保留时间一致,阴性供试品溶液无干扰(见图1)。结果表明方法专属性良好。

2.3 线性关系考察

取1.2.2混合对照品溶液,分别精密量取0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 ml,分别置10 ml量瓶中,加95%甲醇定容至刻度,摇匀,按1.2.1色谱条件分别进样10 μl,采集色谱图。分别以葛根素、五味子醇甲和大黄素峰面积为纵坐标(Y),对应的质量浓度为横坐标(X)制作标准曲线,计算曲线方程和相关系数。结果见表2。

表2 线性范围、回归方程及相关系数

2.4 加样回收试验

取已知含量的参精止渴丸样品(批号:191212),将内容物置研钵中研细,取约0.5 g,精密称定,置50 ml容量瓶中,分别精密量取1.2.2项下葛根素、五味子醇甲和大黄素储备溶液适量,加入到上述容量瓶中,后续按2.3供试品溶液方法处理,得样品加标溶液,同法平行制备6份。按1.2.1色谱条件分别进样10 μl,采集色谱图。根据色谱图中3种待测成分峰面积计算样品中的加标量,与实际加入量计算加标回收率。结果见表3。

表3 加样回收试验结果

2.5 仪器精密度试验

取1.2.2混合对照品溶液,按1.2.1色谱条件进样10 μl,连续进样6次,采集色谱图。结果葛根素、五味子醇甲和大黄素精密度RSD分别为0.67%,1.01%和0.99%,结果表明仪器精密度良好。

1.葛根素;2.五味子醇甲;3.大黄素图1 各溶液典型色谱图Figure 1 Typical chromatogram of mixed reference solutions

2.6 方法重复性试验

取同一批次参精止渴丸样品(批号:191212),按1.2.3供试品溶液方法处理,制备供试品溶液,同法平行制备6份供试品;再按1.2.1色谱条件分别进样10 μl,采集色谱图。结果葛根素、五味子醇甲和大黄素重复性RSD分别为1.17%,1.82%和1.53%,结果表明该方法重复性良好。

2.7 溶液稳定性试验

取参精止渴丸样品(批号:191212),按1.2.3供试品溶液方法处理,制备供试品溶液,分别于室温下放置0,1,3,6,9,12,24 h,按1.2.1色谱条件每个时间节点分别进样10 μl,采集色谱图。结果葛根素、五味子醇甲和大黄素峰面积RSD分别为1.37%,1.09%和0.79%,结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 市售样品检测

取参精止渴丸样品(辽宁中医学院药业有限公司生产,规格:每100丸7 g,批号分别为:191212,200113,200421),分别按1.2.3供试品溶液方法处理,制备供试品溶液,再按1.2.1色谱条件分别进样10 μl,采集色谱图。根据色谱图3种待测成分峰面积计算3份供试品中的含量。结果见表4。

表4 市售样品含量测定结果 (mg/g)

3 讨论

3.1 测定波长的优化

取葛根素对照品,精密称取10 mg,加95%甲醇制备每1 ml溶液中含葛根素10 μg/ml的波长检查溶液,同法制备五味子醇甲和大黄素波长检查溶液。按1.2.1色谱条件,设定扫描波长在200-400 nm,分别进样10 μl,采集色谱和光谱图。结果,葛根素、五味子醇甲和大黄素分别在251,250,253 nm处有最大吸收,3种待测成分最大吸收波长均在252 nm附近。故实验设定检测波长为252 nm。

3.2 流动相的优化

参考《中国药典》2015年版中,葛根中葛根素的测定流动相选择甲醇 ∶水为25 ∶75,五味子中五味子醇甲的测定流动相选择甲醇 ∶水为65 ∶35,大黄中大黄素的测定流动相选择甲醇 ∶0.1%磷酸溶液为85 ∶15[5]。实验分别选择上述3种流动相体系,考察对葛根素、五味子醇甲和大黄素分离情况的影响。结果发现,选择甲醇体系时,分析时间长,尤其是极性最弱的大黄素,出峰时间久、检测效率低。选择乙腈体系时,分析时间短,3种待测成分分离度较好,且效率更高。因此实验选择乙腈 ∶0.1%磷酸溶液作为流动相体系。

综上所述,实验为完善参精止渴丸质量标准,提高该产品的质量控制水平,建立了中药制剂参精止渴丸中葛根素、五味子醇甲和大黄素成分同时检测的HPLC方法。实验结果表明,与药典标准方法比较,本研究建立的方法增加了质量控制药材品种,提高了产品的质量控制水平,此方法科学、简单、检测效率高,可以用于参精止渴丸产品的质量控制。