miR-448在蛛网膜下腔出血发生发展中的作用

郝广志,初广新,刘佳明,梁国标

(解放军北部战区总医院神经外科,沈阳 110016;*通讯作者,E-mail:liangguobiao2011@163.com)

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是脑底或脑表浅部位颅内血管破裂引起的出血性中风,是一种常见的出血性脑卒中疾病,具有较高的发病率和死亡率[1]。其中由脑内动脉瘤破裂导致蛛网膜下腔动脉出血约占85%,即使挽救了患者的生命,幸存者也常伴有神经功能损伤和认知功能障碍,严重地影响了患者的生存质量[2]。研究表明SAH后会引起早期脑损伤(early brain injury,EBI),包括颅内压升高、脑血流和脑灌注压降低、血脑屏障(BBB)损伤、脑水肿、急性脑血管痉挛和神经元凋亡,是导致蛛网膜下腔出血患者不良预后的重要因素[3-5]。研究表明蛛网膜下腔出血后会出现神经元凋亡的情况[6]。李霞等[7]研究发现SAH后神经元的凋亡与JNK/c-Jun/caspase-3信号通路密切相关,诱导细胞凋亡过程。提示减轻细胞凋亡可作为减轻SAH后EBI的新靶点。

Bcl-2/Bax凋亡信号通路作为一种调节细胞凋亡和存活的信号通路,与多种神经系统疾病密切相关[8,9]。潘峰等[10]发现,在缺血性脑卒中模型大鼠中,Bcl-2蛋白表达水平显著降低,Bax蛋白表达水平显著升高,诱导神经元凋亡,造成神经功能障碍。在SAH后,Bcl-2在脑皮质部位的表达呈时间依赖性下降[11]。caspase-3和Bax在下丘脑部位表达量显著上升,而Bcl-2呈现下降趋势[12]。但是Bcl-2在蛛网膜下腔出血中诱导神经细胞凋亡的作用机制还需进一步的探究。

微小RNA(miRNA, microRNA)由19-24个核苷酸组成,能结合到目标mRNA上,进而抑制mRNA的翻译及功能,促进相应mRNA降解。miRNA还可靶向结合到基因启动子特定区域并诱导基因表达[13]。研究表明SAH后存在多种miRNAs异常表达的现象[14],miR-448在多种肿瘤细胞中表达异常,如肝癌[15]、非小细胞肺癌[16]等。本课题组前期研究中通过基因芯片筛查发现miR-448在SAH时表达上调。本研究旨在探讨miR-448对蛛网膜下腔出血的作用及机制,为蛛网膜下腔出血的治疗提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠主动脉血管内皮细胞RAOEC(上海晶抗生物工程有限公司),lipo2000转染脂质体(美国invitrogen公司),FBS、DMEM培养基(美国Gibco公司),Trizol(美国life technologies公司),氯仿、DEPC(DNase/RNase-free)水、异丙醇(北京鼎国生物技术有限公司),报告基因试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),NP40裂解液、反转录试剂盒、SYBR试剂盒(北京天根生化科技有限公司),抗体:Bcl-2,GAPDH和羊抗兔IgG(北京博奥森公司)。

1.2 模型建立

本研究中使用的所有方案均经北部战区总医院动物管理和使用委员会批准。选取体质量在160-180 g之间的成年雄性SD大鼠,购自北部战区总医院实验动物中心,许可证号:SCXL(辽)2014-0002。采用血管内穿刺法[17]构建SAH动物模型,戊巴比妥钠将大鼠麻醉后,暴露出颈内动脉、颈外动脉和左颈总动脉,结扎左颈外动脉并切开,留下一个3 mm的动脉截块,通过大脑中动脉分支将尼龙缝合线插入左侧,缝合线进一步向前推进约3-5 mm,以刺穿动脉,持续10 s后有明显的血流流出即成功建立蛛网膜下腔出血模型;假手术大鼠(sham)采用相同的治疗程序,但不刺破血管,血流也无明显变化。36只大鼠随机分为两组:模型组(n=18)和假手术组(n=18)。

1.3 逆转录定量实时PCR(real-time PCR)检测miR-448在SAH脑组织中的表达

在CFX96 TouthTM实时PCR检测系统(Bio-Rad Lab,Inc.,Hercules,California,U.S.A.)上使用SYBR检测试剂盒进行实时PCR,使用1 μl模板、0.4 μl正向引物、10 μl 2×mix预混剂(含SYBR和ROX)、0.4 μl反向引物、2 μl cDNA和6.2 μl ddH2O,最终体积为20 μl(均来自天根生物科技)。将每次反应的总体积20 μl转移到96孔板上,在95 ℃下培养15 min,随后在94 ℃下5个循环25 s,65 ℃下培养30 s,72 ℃下培养34 s,然后在94 ℃下45个循环20 s,60 ℃下培养34 s。所有样品一式三份。引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.4 Bcl-2在SAH脑组织中的表达

1.4.1 免疫荧光法检测细胞凋亡情况 造模7 d后,在sham组和SAH组随机各取4只大鼠,处死,取脑组织,制作石蜡切片。脱蜡至水后,用50 μl的TUNEL反应缓冲液处理15 μm厚的脑切片,并在37 ℃的黑暗和潮湿的环境中培养1 h,然后在4 ℃的温度下用Bcl-2抗体(1 ∶2 000,北京博奥森公司)培养过夜。切片用PBS洗涤5次,每次10 min,在室温下用二抗(Alexafluor488和Alexafluor594,1 ∶200)孵育2 h。然后用PBS再次洗涤切片5次,每次10 min,然后用DAPI染色5 min,再洗涤3次后,用荧光显微镜观察切片。

1.4.2 蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测组织中Bcl-2表达情况 采用NP40裂解液将组织匀浆吹散,于冰上静置5 min,12 000 r/min,4 ℃离心10 min,然后计算样本蛋白浓度。取30 μg蛋白进行电泳(80-130 V)、转印(100 V,1 h);将脱脂奶粉于室温封闭1 h;加入1 ∶1 000稀释的抗体Bcl-2和GAPDH,4 ℃孵育过夜,TBST室温洗3次。二抗37 ℃,45 min;ECL发光。

1.5 miR-448过表达或低表达的细胞培养

大鼠主动脉血管内皮细胞RAOEC分为:control组、miR-448+AS组和miR-448组,分别转染无意义小链、miR-448+反义链miR-448、miR-448。将RAOEC细胞接种于6孔板中,培养24 h,之后更换为无血清培养基,采用lipo2000脂质体试剂(购置于广州锐博生物科技有限公司),分别向RAOEC转染无意义小链、miR-448+反义链miR-448、miR-448获得。

1.6 miR-448对血管内皮细胞凋亡的影响

分别转染无意义小链、miR-448+反义链miR-448、miR-448的大鼠主动脉血管内皮细胞RAOEC,采用Annexin Ⅴ-PI染色,培养24 h后进行消化、离心,收集下层的细胞沉淀,重新制成单细胞悬液。在每管细胞中分别加入500 μl的Binding Buffer重悬细胞,再依次加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI。轻轻混匀,室温下避光孵育15 min,进行流式检测。

1.7 miR-448对下游靶基因Bcl-2活性和表达的影响

1.7.1 双荧光素酶报告基因实验 为了检测miR-448对Bcl-2靶向作用,首先用Bcl-2上、下游特异性引物扩增Bcl-2的3′UTR序列。将pMIR-REPORT-Luciferase载体进行SpeⅠ和Hind Ⅲ双酶切。利用连接酶将Bcl-2的3′UTR序列与pMIR-REPORT-Luciferase载体连接,命名为pMIR-LUC-Bcl-2。其次当RAOEC细胞处于对数生长期时,接种于96孔板,达到70%融合度时进行转染。将已合成的pMIR-LUC-Bcl-2和pRL-TK分别转染到control组、miR-448+AS组、miR-448组血管内皮细胞中。24 h后,PBS洗涤2次,裂解缓冲液裂解细胞,加入LAR Ⅱ,检测萤火虫荧光素酶活性,随后立即加入海肾荧光素酶底物Stop & Glo Reagent,立即用酶标仪测定海肾荧光。

1.7.2 蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测细胞中Bcl-2的表达情况 Western blotting检测方法同1.4.2,在control组、miR-448+AS组、miR-448组血管内皮细胞系中,检测Bcl-2的蛋白表达情况。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 miR-448在SAH脑组织中的表达

RT-PCR检测大鼠脑组织中miR-448 mRNA的表达情况,发现在SAH组脑组织中miR-448 mRNA的表达量显著高于假手术sham组,差异有统计学意义(P<0.05,见图1)。

与sham组比较,*P<0.05图1 miR-448在SAH脑组织中的表达Figure 1 The expression of miR-448 in SAH brain tissue

2.2 miR-448对血管内皮细胞凋亡的影响

与control组和细胞miR-448低表达的miR-448+AS组相比,miR-448过表达的miR-448组细胞凋亡呈现上升趋势(见图2)。

2.3 Bcl-2在SAH脑组织中的表达

TUNEL染色观察Bcl-2的表达情况,发现在SAH组脑组织中Bcl-2表达显著低于sham组(见图3)。

Western blotting检测Bcl-2的蛋白表达情况,发现在SAH组脑组织中Bcl-2的蛋白表达水平显著低于sham组,差异有统计学意义(P<0.05,见图4)。

与control组和miR-448+AS组比较,*P<0.05图2 miR-448对血管内皮细胞凋亡的影响Figure 2 The effect of miR-448 on apoptosis of vascular endothelial cells

绿色:TUNEL,红色:Bcl-2,蓝色:DAPI图3 Bcl-2 在SAH脑组织中的表达Figure 3 The expression of Bcl-2 in SAH brain tissue

与sham组比较,*P<0.05图4 Bcl-2在SAH脑组织中蛋白表达Figure 4 The protein expression of Bcl-2 in SAH brain tissue

2.4 miR-448对下游靶基因Bcl-2活性和表达的影响

miRDB软件分析发现,miR-448与Bcl-2的3′UTR区域具有结合位点(见图5)。与control组相比,miR-448组血管内皮细胞中Bcl-2活性显著降低;与miR-448组相比,miR-448+AS组血管内皮细胞中Bcl-2活性显著提高(见图6)。

图5 A miR-448对Bcl-2的靶向作用Figure 5 The targeting effect of miR-448 on Bcl-2

在过表达或低表达miR-448的血管内皮细胞系中检测Bcl-2的蛋白表达情况,发现miR-448可抑制Bcl-2的表达(见图7)。

与control组比较,#P<0.05;与miR-448组比较,*P<0.05图6 在血管内皮细胞中miR-448对Bcl-2的活性影响Figure 6 The effect of miR-448 on the activity of Bcl-2 in vascular endothelial cells

与control组比较,#P<0.05;与miR-448组比较,*P<0.05图7 在血管内皮细胞中miR-448对Bcl-2的表达影响Figure 7 The effect of miR-448 on the expression of Bcl-2 in vascular endothelial cells

3 讨论

蛛网膜下腔出血是神经外科常见的脑血管疾病之一,病死率较高,幸存患者由于早期脑损伤和迟发性脑缺血常常伴有神经功能损伤,是患者SAH不良预后主要原因。在临床实践中,对于患者早期脑损伤的干预能够有效地减少迟发性神经损伤的发生,有效提高患者的生存质量[18]。在对SAH后EBI发生机制研究中发现,神经元凋亡是导致EBI中神经功能障碍的主要因素[19]。Bcl-2是抗凋亡分子,可通过改变细胞膜的通透性抑制相关促凋亡蛋白的释放和表达,如细胞色素C等,阻碍细胞凋亡一系列的级联反应,其表达降低与肿瘤细胞的凋亡率呈正相关[20]。直肠癌相关研究发现,miR-1915能够靶向与Bcl-2结合,诱导肿瘤细胞发生凋亡[21]。本研究发现在SAH脑组织中Bcl-2蛋白表达水平显著低于sham组,提示SAH后存在神经细胞凋亡的现象,且Bcl-2蛋白参与神经细胞凋亡过程。

近些年,研究发现非编码RNA的生物学功能在肿瘤发生发展进程中发挥重要作用,包括miRNA、IncRNA、circRNA等[22]。miRNA是一类单链非编码小分子RNA,能够定向与靶基因mRNA结合,抑制其蛋白的翻译过程,是调节蛋白质表达的重要调节因子,其次有研究表明在人脑组织发生损伤后,脑miRNA表达量会发生显著变化[23]。研究表明其在创伤性脑损伤发生发展过程中发挥重要作用,如细胞凋亡和神经元可塑性等[24]。本课题组前期在SAH组和sham组脑组织中通过芯片筛选得到差异表达的miR-448。本研究通过RT-PCR得到相似结论,提示miR-448在SAH后脑组织损伤中发挥重要作用。同时miR-448已被证实参与调控多种疾病发生发展,在肺腺癌中OIP5-AS1靶向作用miR-448/Bcl-2促进肿瘤细胞的增殖,miR-448-3p通过调节klf5的表达抑制颅内动脉瘤的发生发展[25,26]。为了进一步探究miR-448在SAH后网膜下腔出血发生发展作用机制,首先分别构建过表达和低表达miR-448的血管内皮细胞,结果显示miR-448组细胞凋亡水平显著高于miR-448+AS组,提示miR-448可促进血管内皮细胞的凋亡。其次,通过miRDB软件分析,miR-448能够特异性地结合到Bcl-2的3′UTR区域,荧光素酶报告基因实验结果提示miR-448可显著调节Bcl-2活性,且在miR-448组细胞系中Bcl-2蛋白表达水平显著低于低miR-448+AS组,提示miR-448可抑制Bcl-2的表达。

综上所述,miR-448通过调节Bcl-2的表达参与蛛网膜下腔出血EBI过程,为加深对SAH后EBI相关病理机制的认识,为临床治疗蛛网膜下腔出血患者脑损伤,减低患者的病死率和伤残率提供理论数据。接下来本课题将探究参与miR-448/Bcl-2过程的信号通路及其他因子,旨在阐明miR-448在蛛网膜下腔出血中的生物学作用。