雌、孕激素通过TGF-β影响宫腔粘连的形成

陈 庆,赵金燕,张 雪,公丕军,赵 艳,薛 翔

(西安交通大学第二附属医院妇产科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:xgxue@263.net)

宫腔粘连(intrautine adhesion,IUA)也被称为Asherman综合征,1948年由Asherman首次报道,其临床表现为周期性下腹痛、月经量减少、闭经、反复流产及不孕等症状[1]。IUA主要由子宫内膜基底层损伤引起,导致宫腔粘连或瘢痕形成,宫腔或宫颈管部分或完全闭塞[2]。近年来,随着子宫手术操作的增多,宫腔粘连的发生率在我国呈上升趋势[3],IUA已成为一个导致女性不孕的主要因素。

虽然人们对IUA的病因有所认识,但对于IUA的具体形成机制仍不清楚。雌激素和孕激素是由卵巢分泌的两种类固醇激素,它们在调节子宫内膜细胞增殖及维持子宫内膜正常结构和功能方面具有重要作用[4,5]。研究发现,雌、孕激素受体(ER/PR)与宫腔粘连的发生密切相关[6,7],并且雌激素、孕激素治疗能增加子宫内膜的厚度和体积,临床上也已采用雌激素作为宫腔粘连分离术预防粘连复发的手段[8]。但雌、孕激素是否影响宫腔粘连的发生及其内在机制,目前尚无报道。因此,本研究探讨雌、孕激素在IUA形成中的作用及机制,对于宫腔粘连的防治具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

ER兔抗人多克隆抗体、PR兔抗人多克隆抗体均购自北京博奥森生物公司;TGF-β、β-actin购自美国Santa Cruz公司;羊抗兔SP试剂盒(武汉博士德公司)。苯甲酸雌二醇(上海通用药业),黄体酮(广州明兴制药厂)。

1.2 组织标本

96例宫腔粘连组织标本收集于西安交通大学第二附属医院妇产科2011年1月至2013年1月因宫腔粘连行宫腔镜下粘连松解术的患者,年龄21-43岁,30例正常子宫内膜组织收集于同期因不孕行宫腔镜检查的非IUA患者,年龄20-43岁,平均(28.5±1.6)岁,标本均取自增殖期子宫内膜组织。实验前患者已签署知情同意书,并取得西安交通大学第二附属医院医学伦理委员会的批准(2019-伦审-研第020号)。纳入标准:①经宫腔镜检查确诊的宫腔粘连患者;②年龄≥20岁;③知情同意并自愿参加研究者。排除标准:①近3个月使用雌、孕激素或促性腺激素释放激素类似物等激素类治疗;②怀孕或授乳;③有功能性子宫出血、子宫腺肌症、子宫内膜息肉、子宫内膜异位症、子宫平滑肌瘤。其中一部分标本中性福尔马林固定,石蜡包埋,以备免疫组化检测ER、PR,另一部分标本液氮保存,以备Western blot检测ER、PR及TGF-β。

1.3 免疫组化检测及结果判定

采用免疫组化SP法检测,严格安照试剂盒说明书步骤操作。阴性对照以PBS代替一抗。免疫组化结果判定,依据阳性细胞数和染色强度综合评分[9]。

在油镜下,按阳性细胞百分比分为5个等级:<10%为0分,10%-25%为1分,25%-50%为2分,50%-75%为3分,≥75%为4分;按染色强度分为4个等级:无着色为0分,浅黄色为1分,黄色为2分,黄褐色为3分。最终评分按如下公式计算:免疫反应评分(immunoreactivity score,IRS)=阳性细胞百分比评分×染色强度评分。最后总评分>3定义为阳性染色。

1.4 Western blot检测ER、PR及TGF-β表达

提取组织或细胞蛋白,BCA法蛋白定量,用SDS-PAGE分离,湿式转移到PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h,一抗(ER兔抗人多克隆抗体1 ∶200;PR兔抗人多克隆抗体1 ∶200;TGF-β兔抗人多克隆抗体1 ∶300)于4 ℃下孵育过夜,室温下,TBST洗涤,10 min×3次,辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG(1 ∶10 000)室温下孵育1 h。增强化学发光(ECL),X胶片显影、定影。采用Quantity One软件进行灰度分析。

1.5 动物模型制备

选择9-11周龄的健康普通级新西兰雌兔24只,体质量2 000-2 800 g。常规单笼饲养适应环境1周后,随机分为4组:正常生理组、低雌低孕组、低雌高孕组和高雌低孕组,每组6只。低雌低孕组为切除双侧卵巢,正常生理组仅切除双侧卵巢周围的脂肪等组织,低雌高孕组为切除双侧卵巢后立即开始给予1.0 mg黄体酮,高雌低孕组为切除双侧卵巢后立即开始给予1.0 mg苯甲酸雌二醇,肌内注射,2次/周,持续4周。低雌低孕组和正常生理组,给予注射生理盐水。

两周后在3%戊巴比妥钠麻醉下,纵行剖开雌兔双侧子宫宫体部,右侧宫腔于子宫内膜与肌层交界处用自制的刮勺尽量刮除内膜组织,并于被搔刮宫体的远端缝扎、切断剩余的宫体,以避免术后远端内膜爬行;左侧宫腔仅暴露内膜,不行搔刮。术后缝合双侧宫腔至正常形态。继续原方案用药2周,并常规使用抗生素3 d预防感染。3%戊巴比妥钠麻醉,空气栓塞处死,采集子宫内膜组织,4%甲醛固定,以备HE、Masson染色。

1.6 伊红-苏木素(H&E)及Masson染色

子宫内膜组织用4%甲醛固定,石蜡包埋,之后采用苏木精-伊红和Masson常规染色。参照以下标准进行阅片。HE评分标准[10]:①以正常生理组高倍镜视野下所含子宫内膜腺体数目,计为0分;②随机选取右侧子宫内膜切片的4个视野,读取每高倍镜视野下子宫内膜腺体数目并求均值,如腺体数目相对于正常雌孕激素组减少1%-10%,计1分;减少11%-25%,计2分;减少26%-50%,计3分;减少51%-75%,计4分;减少76%-100%,计5分;(3)类比于以上标准,如腺体数目增加则分别计为-1、-2、-3、-4、-5分。Masson评分标准[10]:①以正常生理组高倍镜视野下子宫内膜中所含胶原纤维成分比例为标准,计为0分;②随机选取各组兔右侧(即搔刮侧)子宫内膜切片4个视野,读取每高倍镜视野下子宫内膜中胶原纤维所占比例,如胶原纤维所占比例相对于正常雌孕激素组增加1%-10%,计1分;增加11%-25%,计2分;增加26%-50%,计3分;增加51%-75%,计4分;增加76%-100%。计5分;③类比于以上标准,如胶原纤维所占比例减少则分别计为-1、-2、-3、-4、-5分。

子宫内膜纤维化包括腺体减少和胶原纤维增加两个变量,将每只动物HE和Masson染色评分结果相加,即得出子宫内膜纤维化的半定量评分,评分越高提示内膜纤维化程度越重。

1.7 细胞培养

子宫内膜癌细胞株RL95-2购自中科院上海细胞研究所,采用DMEM高糖培养基,置于含5% CO2的37 ℃培养箱中培养。将细胞分为4组,即对照组(Con)、低雌低孕组(LE+LP)、低雌高孕组(LE+HP)和高雌低孕组(HE+LP)。其中,低雌低孕组给予雌、孕激素各2 nmol/L,低雌高孕组给予2 nmol/L雌激素和15 nmol/L孕激素,而高雌低孕组给予15 nmol/L雌激素和2 nmol/L孕激素。培养72 h后,收获细胞,提取蛋白于-80 ℃保存。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 ER、PR在宫腔粘连组织中的表达

免疫组化染色显示,ER及PR主要表达在细胞核(见图1),ER在正常子宫内膜及宫腔粘连组织中的阳性率分别为40.0%(12/30)及18.8%(18/96);PR在正常子宫内膜及宫腔粘连组织中的阳性率分别为20.0%(6/30)及34.4%(33/96),经卡方检验,差异均具有统计学意义(P<0.01)。进一步Western blot检测结果表明,ER在宫腔粘连组织中的表达明显低于正常子宫内膜组织(0.28±0.04vs0.68±0.03),PR在宫腔粘连组织中的表达则明显高于正常子宫内膜组织(1.47±0.06vs0.51±0.04),半定量分析后,经t检验,差异均有统计学意义(P<0.05,见图2)。

图1 ER和PR在IUA组织中的表达 (免疫组化染色,×40)Figure 1 the expression of ER and PR in IUA tissues (HE,×40)

2.2 雌、孕激素对子宫内膜纤维化的影响

各组雌兔体内雌、孕激素水平有明显差异,经方差分析,差异具有统计学意义(P<0.01,见表1)。

表1 给药两周后兔血清中E2和P的水平

通过HE及Masson染色,兔子宫内膜纤维化评分显示,与正常生理组及低雌低孕组相比,低雌高孕组呈明显升高,而高雌低孕组呈明显降低,经方差分析,差异均具有统计学意义(P<0.01,见图3)。

与正常子宫内膜比较，*P<0.05图2 Western blot检测ER和PR在IUA组织中的表达Figure 2 Expression of ER and PR in IUA tissues measured by Western blot

2.3 TGF-β在宫腔粘连组织的表达

Western blot检测显示,与正常子宫内膜相比,TGF-β在宫腔粘连组织中的表达明显升高的,差异有统计学意义(P<0.01,见图4)。采用Pearson相关分析ER和PR与TGF-β表达的相关性,结果发现在宫腔粘连组织中TGF-β与ER的表达呈负相关(r=-0.88,P<0.01),而与PR的表达呈正相关(r=0.81,P<0.05,见图5)。

与正常正常生理组相比较,*P<0.05,**P<0.01图3 雌、孕激素对兔子宫内膜纤维化的影响 (×40)Figure 3 Effect of estrogen and progeston on the endometrial fibrosis of rabbits (×40)

与正常子宫内膜组织相比,*P<0.05图4 Western blot检测TGF-β在正常子宫内膜及IUA组织的表达Figure 4 Expression of TGF-β in normal endometrial and IUA tissues by Western blot

图5 TGF-β与ER、PR在IUA组织表达的相关分析Figure 5 Correlation analysis between TGF-β and ER, PR in IUA tissues

2.4 雌、孕激素对TGF-β在子宫内膜细胞表达的影响

通过对RL95-2细胞分别给予不同剂量的雌、孕激素刺激72 h后,Western blot检测显示,与对照组相比,低雌高孕组RL95-2细胞中TGF-β的表达出现了明显升高,相反,高雌低孕组则出现了明显降低,灰度分析后,差异有统计学意义(P<0.05,见图6)。

与对照组相比,*P<0.05图6 Western blot检测雌孕激素对TGF-β在RL95-2细胞中表达的影响Figure 6 Effect of estrogen and progeston on the expression of TGF-β in RL95-2 cells by Western blot

3 讨论

机械损伤或感染性损伤是IUA发生的主要危险因素,目前宫腔镜下经宫颈粘连松解术是临床治疗IUA的首选方案[11]。然而,术后粘连复发率仍较高,尤其是重症IUA的复发率高达20%-62%[12]。因此,阐明IUA形成的分子机制具有重要意义。

ER、PR作为与女性生殖内分泌调节有关的重要物质,与子宫内膜的修复密切相关,在子宫全层中均有表达[13]。本研究首先通过免疫组化及Western blot检测发现,ER在IUA组织中呈低表达,PR在IUA组织中呈高表达,这一结果提示ER及PR可能与IUA的形成有关。雌、孕激素通过特异性识别ER和PR,与ER、PR结合形成的二聚体将激素信号转化成一系列的化学反应,最终调节基因转录、蛋白质合成以及维持子宫的正常功能[14]。为探讨雌、孕激素在IUA形成中的作用,本研究通过动物实验发现,低雌高孕组子宫内膜纤维化评分与正常生理组及低雌低孕组相比明显升高,而高雌低孕激素组则明显降低,这表明低雌高孕激素能促进雌兔子宫内膜纤维化,相反,高雌低孕激素则抑制雌兔子宫内膜纤维化,这表明雌、孕激素在IUA形成中具有重要作用,但其作用可能相反。

TGF-β作为TGF家族中的一员,是目前已知最重要的促纤维形成细胞因子,可由多种细胞产生。TGF-β对细胞的生长、分化、迁移、凋亡及细胞外基质的生成均具有调节作用,已经成为细胞纤维化的重要标志[15]。研究发现,TGF-β在许多子宫内膜相关性疾病的发生中起重要作用,如子宫内膜异位症[16]、子宫内膜癌[17]等。本研究通过Western blot检测发现,TGF-β在IUA组织中呈高表达,这与以往研究相一致[18,19]。Pearson相关分析发现,在宫腔粘连组织中TGF-β与PR的表达呈正相关,与ER的表达呈负相关。这一结果提示TGF-β表达可能与雌、孕激素有关。为了进一步验证雌、孕激素对TGF-β表达的影响,通过体外细胞培养发现,与对照组相比,低雌高孕激素处理可引起RL95-2细胞中TGF-β表达升高,而高雌低孕激素处理则导致RL95-2细胞中TGF-β的表达降低,这表明雌孕激素影响TGF-β在子宫内膜细胞的表达。

综上所述,本研究表明雌、孕激素可能在IUA的发生、发展中起重要作用,雌激素能抑制宫腔粘连的形成,而孕激素则促进宫腔粘连的形成,其机制与TGF-β的表达有关。这为宫腔粘连的临床治疗提供了一个潜在靶点,由于雌、孕激素在体内的作用是复杂的。因此,其具体的分子机制尚需今后进一步研究。