附子理中汤对慢加急性肝衰竭大鼠肝损伤的影响及其作用机制

陈 微,孙克伟,叶锡勇

(1湖南中医药大学第一附属医院感染性疾病科,长沙 410000;2湖南中医药大学第一附属医院肝病科;3湖南中医药大学第一附属医院院感科)

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)是在肝硬化、慢性肝炎、慢性胆汁淤积性肝病等慢性肝病基础上发生的急性或亚急性肝功能失代偿综合征,常伴随一个甚至多个器官功能衰竭,病情进展迅速,病死率高[1,2]。目前临床采用抗病毒、肝移植、人工肝等治疗手段治疗ACLF,明显降低了病死率,但总体治疗效果仍不够理想[3]。研究认为,肝组织在肝衰竭过程中经受免疫损伤、缺血缺氧性损伤及内毒素血症三重致死性打击,炎症反应是该病理进展过程的中心环节[4]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)是细胞内模式识别受体,能激活核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路,诱导炎症级联反应,参与多种疾病的炎症损伤过程[5,6]。已有研究显示,TLR4/NF-κB通路参与肝衰竭过程[7]。附子理中汤是传统中药汤剂,能显著改善缺血再灌注急性肾损伤大鼠的肾功能,改善非酒精性脂肪肝大鼠肝脏病理变化,但对ACLF的影响尚鲜有研究[8,9]。本研究将观察附子理中汤对ACLF大鼠肝损伤的减轻作用,并从炎症反应方面探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠,体质量200-230 g,购于上海灵畅生物科技有限公司,生产许可证号:SCXK(沪)2018-0003。饲养条件:自由饮水、进食,温度为22-26 ℃,相对湿度为40%-70%,12 h照明/12 h黑暗。

1.1.2 主要试剂 附子理中汤配制:人参9 g,白术9 g,干姜9 g,炙甘草6 g,炮附子9 g,加4倍的水煎煮60 min,过滤,滤渣加3倍的水煎煮40 min,过滤,滤渣加入2倍的水煎煮30 min,过滤,将3次滤液混合,低温放置1 d,过滤,使用水浴将滤液浓缩成生药含量1.5 g/ml的药液,4 ℃存放备用。乳果糖(货号:L77521)购自上海吉至生化科技有限公司;大鼠内毒素、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(货号:HL20392、HL20064、HL20700、HL20040)购自上海哈灵生物科技有限公司;HE染色试剂盒(货号:RS3390-3)购自金克隆(北京)生物技术有限公司;TLR4抗体、NF-κB p-p65抗体、NF-κB p65抗体、GAPDH抗体、羊抗兔IgG(货号:ab13867、ab239882、ab16502、ab186930、ab133470)购自美国Abcam公司。

1.1.3 主要仪器 AU5800型全自动生化分析仪购自美国Beckman公司;MK3型酶标仪购自美国Thermo公司;CKX41SF型显微镜购自日本Olympus公司;GS-800型凝胶扫描成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 实验造模及分组、给药 大鼠适应性喂养1周,参照丛伟[10]造模方法,建立ACLF大鼠模型,共分为两个阶段。①构建大鼠胆汁淤积性肝硬化模型:大鼠禁食12 h后进行结扎胆总管手术,用4%水合氯醛对大鼠行腹腔注射麻醉(0.7 ml/100 g),腹部备皮,无菌消毒,打开腹腔,分离大鼠胆总管,用4-0丝线结扎,从结扎中间段将胆总管剪断,用生理盐水清洗腹腔后缝合,胆管结扎4周后存活的大鼠即已成功建立胆汁淤积性肝硬化模型。②建立大鼠ACLF模型:取已成功建立胆汁淤积性肝硬化模型的大鼠,禁食12 h,按0.2 g/kg给予大鼠0.2 g/ml D-氨基半乳糖溶液腹腔注射,24 h后即可在诱导肝硬化基础上诱导急性肝损伤,建立大鼠ACLF模型。

将成功建立ACLF模型的40只大鼠分为ACLF组、阳性组和附子理中汤低、中、高剂量组,每组8只大鼠,另取8只不造模的大鼠为对照组。附子理中汤低、中、高剂量组大鼠分别灌胃7.5,15,30 g/kg附子理中汤[11],阳性组大鼠灌胃13.5 g/kg乳果糖[12],对照组、ACLF组大鼠灌胃等量生理盐水,每日1次,连续给药两周。

1.2.2 大鼠肝功能测定 末次给药24 h后,按0.7 ml/100 g给予大鼠4%水合氯醛腹腔注射麻醉,将大鼠以仰卧位在解剖台上固定,开腹采集下腔静脉血3-5 ml,血液样品经室温静置30 min后3 000 r/min离心15 min,分离上清,分为两份。一份血清用生化分析仪检测血清门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、总胆红素(total bilirubin,TBil)、前白蛋白(prealbumin,PA)水平。

1.2.3 ELISA法检测大鼠血清内毒素及炎症相关因子表达情况 剩余一份血清使用内毒素、IL-6、IL-8、TNF-α ELISA试剂盒,按照试剂盒说明书操作步骤,检测血清内毒素及IL-6、IL-8、TNF-α水平。

1.2.4 大鼠肝组织病理形态学观察 大鼠开腹采集下腔静脉血后,均剪取同一叶肝组织,用生理盐水清洗,分为两份。一份用于Western blot检测,另一份置于10%中性甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋,切片,脱蜡,HE染色,显微镜观察肝组织病理形态学。

1.2.5 蛋白印迹(Western blot)法检测大鼠肝组织中TLR4/NF-κB通路相关蛋白的表达 剩余一份肝组织在冰上裂解提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,蛋白样品变性后行SDS-PAGE凝胶电泳,将蛋白转至PVDF膜,脱脂奶粉封闭1 h,加入一抗(TLR4抗体、NF-κB p-p65抗体、NF-κB p65抗体、GAPDH抗体,1 ∶1 000)孵育过夜,用TBST洗涤,加羊抗兔IgG二抗(辣根过氧化物酶标记,1 ∶2 000)孵育1 h,ECL显色曝光,凝胶扫描成像系统扫描图像,分析条带灰度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠肝功能指标

与对照组相比,ACLF组大鼠血清AST、ALT、TBil水平显著升高(P<0.05),PA水平显著降低(P<0.05);与ACLF组相比,阳性组与附子理中汤低、中、高剂量组大鼠血清AST、ALT、TBil水平显著降低(P<0.05),PA水平显著升高(P<0.05);阳性组与附子理中汤低剂量组大鼠血清AST、ALT、TBil、PA水平差异无统计学意义(P>0.05);与阳性组相比,附子理中汤中、高剂量组大鼠血清AST、ALT、TBil水平显著降低(P<0.05),PA水平显著升高(P<0.05);随着附子理中汤剂量的升高,大鼠血清AST、ALT、TBil水平显著降低(P<0.05),PA水平显著升高(P<0.05,见表1)。

表1 各组大鼠血清AST、ALT、TBil、PA水平比较

2.2 各组大鼠血清内毒素及炎症相关因子表达情况

与对照组相比,ACLF组大鼠血清内毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平显著升高(P<0.05);与ACLF组相比,阳性组与附子理中汤低、中、高剂量组大鼠血清内毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平显著降低(P<0.05);阳性组与附子理中汤低剂量组大鼠血清内毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05);与阳性组相比,附子理中汤中、高剂量组大鼠血清内毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平显著降低(P<0.05);随着附子理中汤剂量的升高,大鼠血清内毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平显著降低(P<0.05,见表2)。

表2 各组大鼠血清内毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平比较

2.3 各组大鼠肝组织病理形态

对照组大鼠肝组织中细胞排列整齐,无变性、坏死,未见炎性细胞浸润;ACLF组大鼠肝组织中肝细胞可见片状坏死,可见炎细胞浸润及纤维组织增生;阳性组及附子理中汤低、中、高剂量组肝组织病理损伤较ACLF组均有不同程度地减轻(见图1)。

图1 各组大鼠肝组织病理形态 (HE染色,×200)Figure 1 Pathological morphology of liver tissue of rats in each group (HE staining,×200)

2.4 各组大鼠肝组织中TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达情况

与对照组相比,ACLF组大鼠肝组织中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与ACLF组相比,阳性组和附子理中汤低、中、高剂量组大鼠肝组织中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表达水平显著降低(P<0.05);阳性组与附子理中汤低剂量组大鼠肝组织中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与阳性组相比,附子理中汤中、高剂量组大鼠肝组织中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表达水平显著降低(P<0.05);随着附子理中汤剂量的升高,大鼠肝组织中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表达水平显著降低(P<0.05,见图2、表3)。

表3 各组大鼠肝组织中TLR4、NF-κB p-p65、NF-κB p65蛋白表达水平比较

图2 各组大鼠肝组织中TLR4、NF-κB p-p65、NF-κB p65蛋白表达情况Figure 2 Expression of TLR4,NF-κB p-p65,NF-κB p65 proteins in liver tissue of rats in each group

3 讨论

ACLF是在慢性肝病基础上短期内出现的急性或亚急性肝功能失代偿的临床症候群,临床主要表现为极度乏力、黄疸迅速加深、出血倾向、明显的消化道症状、失代偿性腹水等,疾病进展快,3个月病死率可高达50%[13]。由于肝源缺乏,肝移植治疗具有明显的限制,目前ACLF治疗仍以内科药物治疗为主。因此,寻找高效的ACLF治疗药物备受人们重视。丛伟[10]建立ACLF模型方法较其他造模方法具有简单、快速、有效、便于临床药物研究的特点,故本研究采用其造模方法建立ACLF模型。HE染色可见ACLF组大鼠肝组织中肝细胞存在片状坏死,可见炎细胞浸润及纤维组织增生,血清检测可见肝功能指标AST、ALT、TBil、内毒素及炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α水平显著升高,PA水平显著降低,提示大鼠体内炎症反应加剧,大鼠肝脏功能已明显恶化,肝脏对内毒素的灭活能力明显下降。

附子理中汤是传统中药汤剂,由白术、人参、炙甘草、干姜和炮附子配制而成,其中,人参的主要成分人参皂苷具有保肝、护肝作用;炙甘草的活性成分甘草素具有抗炎、抗氧化作用,能抑制肝纤维化[14,15]。谭玮璐等[16]研究发现,附子理中汤可能通过调节肠道黏膜NALP-3炎性体,减少肠道炎性物质释放,并降低过强的免疫应答,改善腹泻型肠易激综合征症状。张艳晓等[17]研究显示,附子理中汤治疗脾肾阳虚型溃疡性结肠炎具有较好的疗效,其作用机制可能与降低血清促炎因子及细胞间黏附因子表达水平有关。杨家耀等[9]研究表明,附子理中汤能减轻非酒精性脂肪肝大鼠肝脏损伤,降低炎症因子释放。本研究结果显示,使用附子理中汤治疗ACLF大鼠后,可见大鼠肝组织病理损伤减轻,同时大鼠血清AST、ALT、TBil、内毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平显著降低,PA水平显著升高,且随着剂量的升高,其疗效也在不断提高,提示附子理中汤能降低ACLF大鼠体内炎症水平,改善肝组织损伤,提高大鼠肝功能,加强肝脏对内毒素的灭活能力。研究发现,乳果糖、肠道微生态调节剂等能改善ACLF患者预后,其作用机制可能与降低炎症反应及内毒素血症有关[12]。乳果糖是一种人工合成双糖,不被胃肠黏膜双糖酶分解,能调节肠道菌群,减少肠道内毒素产生[18]。本研究采用乳果糖作为阳性药物判断附子理中汤对ACLF的疗效,结果显示,中、高剂量的附子理中汤疗效均高于乳果糖,提示附子理中汤治疗ACLF在减少肠道内毒素产生、减轻肝脏损伤、降低炎症反应方面疗效甚佳,具有一定临床价值。

TLR4/NF-κB信号通路是诱发炎症反应的重要通路,抑制其激活能抑制肝纤维化,进而改善肝功能[19]。Du等[20]研究发现,Kaempferol保护肝细胞免受Acetaminophen肝毒性的作用机制与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。马威等[21]研究表明,附子理中汤能减轻非酒精性脂肪肝大鼠肝组织炎症损伤,其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB p65信号通路激活有关。本研究显示,ACLF组大鼠肝组织中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表达水平较对照组显著升高,提示TLR4/NF-κB信号通路参与ACLF大鼠肝组织的病理学改变过程。使用附子理中汤治疗后,ACLF大鼠肝组织中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表达水平显著降低,提示附子理中汤改善ACLF肝损伤的机制可能涉及对TLR4/NF-κB信号通路的抑制。

综上所述,附子理中汤能改善ACLF大鼠肝损伤,减轻炎症反应,改善肝功能,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。