复治肺结核患者外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞与细胞因子、自由基生成的关系分析

赵新惠，王德翠，田新村，魏海冬，刘观斌（滨州市中心医院检验科 山东 滨州 251700）

肺结核是威胁人类健康的公共性卫生疾病，该病由结核分枝杆菌感染引起，病原菌的数目和毒理是决定病情转归的关键因素。结核分枝杆菌侵入呼吸道后，机体能够通过自身的免疫应答机制来清除病原菌；而当机体免疫应答发生紊乱时，侵入呼吸道的结核分枝杆菌无法并清除并不断繁殖，进而造成肺结核的发生和发展。近年来，机体细胞免疫应答紊乱与结核分枝杆菌感染的关系受到了越来越多的关注，多种介导细胞免疫应答的免疫细胞含量及相应细胞因子的分泌均发生改变。调节性T细胞是在细胞免疫应答中发挥负性调控的T细胞亚群，细胞表面的标志分子为CD4、CD25及Foxp3，能够通过细胞接触抑制以及分泌抑制性细胞因子的方式来发挥负性免疫调控作用[1]。复治肺结核患者是耐药结核病的高发人群、临床治疗棘手[2]，为了明确Treg细胞在复治肺结核发生过程中所起到的作用，本研究具体分析了复治肺结核患者外周血CD4+、CD25+、Foxp3+Treg与细胞因子、自由基生成的相关性。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年3月—2020年6月在我院就诊的复治肺结核患者和初治肺结核患者分为复治组34例和初治组42例，均参照中华医学会结核病学分会制定的肺结核诊断和治疗指南进行诊断[3]，排除合并恶性肿瘤、矽肺、尘肺、自身免疫性疾病的患者。复治组共34例，男性18例、女性16例，年龄31～47岁，平均（39.41±5.58）岁，合并糖尿病9例、高血压5例；初治组共42例，男性24例、女性18例，年龄32～45岁，平均（38.93±4.92）岁，合并糖尿病13例、高血压5例。另取同期体检的50名健康者作为对照组，男性28名、女性22名，年龄33～50岁、平均（39.41±4.59）岁。三组一般资料比较无统计学差异（P＞0.05），有可比性。

1.2 外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞的测定

取三组的空腹肘静脉血2 m L，肝素抗凝后加入红细胞裂解液，孵育15 m i n后离心得到细胞沉淀，调节细胞密度至1×104/L后避光孵育C D4+、C D25+、Foxp3+的荧光抗体20 min，磷酸盐缓冲液洗涤离心2次后，在流式细胞仪上测定CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞的含量。

1.3 血清指标的检测方法

取三组的空腹肘静脉血8 mL，离心分离血清后采用酶联免疫吸附法测定高迁移率族蛋白1（HMGB1）、巨噬细胞刺激蛋白（MSP）、单核细胞趋化蛋白（MCP1）、干扰素诱导蛋白10（IP-10）、巨噬细胞炎症蛋白1α（MIP-1α）的含量，采用分光光度法测定对氧磷酶1（PON1）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX），采用二甲酚橙法测定总氧化态（TOS）、总抗氧化态（TAS）的含量。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 18.0统计软件进行处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析；计数资料用频数表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 外周血中CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞的比较

初治组、复治组、对照组外周血中CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞含量分别为（1.78±0.25）%、（2.83±0.37）%、（1.03±0.17）%。经方差分析，三组间CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞的比较有统计学差异（F=474.73,P＜0.05），且复治组外周血中CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞的含量高于初治组及对照组（P＜0.05）。

2.2 血清中炎症细胞因子的比较

三组间血清HMGB1、MCP1、MSP、IP-10、MIP-1α的比较差异有统计学意义（P＜0.05）；与初治组及对照组比较，复治组血清中HMGB1、MCP1、MSP、IP-10、MIP-1α的含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 三组间血清炎症细胞因子的比较（±s）

表1 三组间血清炎症细胞因子的比较（±s）

MSP/（pg·mL-1）复治组34 5.68±0.78 265.12±33.29 302.39±32.95初治组42 3.89±0.52 229.34±32.39 252.31±29.93对照组50 3.12±0.38 132.48±15.95 213.48±29.58 F 216.50 272.75 85.357 P 0.000 0.000 0.000组别 例数 HMGB1/（ng·mL-1）MCP1/（pg·mL-1）MIF-1α/（pmol·L-1）复治组34 4.85±0.64 39.12±4.58初治组42 3.31±0.45 28.41±3.77对照组50 2.45±0.32 23.12±3.39 F 267.93 174.67 P 0.000 0.000组别 例数 IL-10/（μmol·L-1）

2.3 血清中自由基生成指标的比较

三组间血清GPX、TOS、TAS的比较差异有统计学意义（P＜0.05）；与初治组及对照组比较，复治组血清中TOS的含量明显升高，GPX、TAS的含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 三组间血清自由基生成指标的比较（±s）

表2 三组间血清自由基生成指标的比较（±s）

TAS/（μmol·L-1）复治组34 75.92±9.49 23.41±3.29 1.47±0.22初治组42 95.31±11.35 14.85±1.85 1.94±0.29对照组50 125.42±14.83 7.39±0.94 2.53±0.33 F 169.44 593.67 139.01 P 0.000 0.000 0.000组别 例数 GPX/（U·mL-1）TOS/（μmol·L-1）

3.讨论

复治肺结核的发生与结核杆菌的数目、毒理以及机体的抗感染能力均有密切关系[4]。机体抗结核感染的能力与体内细胞免疫应答直接相关，C D4+、C D25+、F o x p3+T细胞、即T r e g细胞是参与细胞免疫应答负性调控的细胞亚群，能够抑制免疫应答并增加多种病原菌感染的风险。本文对复治肺结核患者外周血中Treg细胞的分析发现：复治组外周血中CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞的含量显著低于初治组及对照组（P＜0.05）。结果表明Treg细胞的增多与复治肺结核的发生有关，结合Treg的生物学功能推测，增多的Treg能够抑制细胞免疫应答对结核分枝杆菌的清除作用、进而造成复治肺结核的发生。

在复治肺结核患者体内，持续的结核分枝杆菌感染具有极强的致炎活性，能够引起体内炎症反应发生级联激活并增加多种炎症细胞因子的释放。HMGB1属于晚期炎症介质，能够通过其促炎活性来保证炎症反应处于持续激活的状态[5]；MCP1和MSP分别促进单核细胞和巨噬细胞定向移动[6-7]；IP-10、MIP-1α分别促进淋巴细胞、中性粒细胞的趋化运动[8]。对复治肺结核患者血清中上述炎症细胞因子的分析发现：复治组血清中HMGB1、MCP1、MSP、IP-10、MIP-1α的含量显著高于初治组及对照组且与Treg呈正相关。结果表明复治肺结核患者体内Treg的增多能够在加重结核分枝杆菌感染的基础上促进体内炎症反应激活、增加炎症细胞因子的分泌。

炎症反应的激活过程还能产生自由基并通过氧化应激反应来造成局部组织发生损伤[9]。大量生成的自由基能够使体内TOS明显增多，同时也会使抗氧化酶GPX大量消耗；TOS和TAS的变化最终造成氧化还原的平衡被打破[10]。这一结果表明复治肺结核患者体内Treg的增多能够在加重结核分枝杆菌感染的基础上促进氧自由基的生成、加重氧化应激反应。

综上所述，复治肺结核患者外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞明显增多；增多的CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞能够造成免疫细胞因子紊乱、炎症细胞因子及自由基生成增多。