基因扩增检测方法对结核性胸腔积液的诊断价值分析

王 建，王佃成，张 盟，劳海黎，孙义军

（滨州市中心医院检验科 山东 滨州 251700）

结核病中肺脏是最常见的发病器官，结核性胸腔积液（tuberculous pleural effusion, TPE）是肺结核的一种常见类型。医院常规使用涂片抗酸染色镜检和罗氏培养不仅检敏感性较低[1-2]，所需时间过长，胸膜活检阳性率高但是为有创性检查[3]，导致临床医生早期只能通过经验和诊断性治疗来诊断TPE，可能导致误诊或者延误诊断，因此应该在疾病的早期寻找准确有效的检测方法，提高TPE患者的诊断准确率。本次采用基因扩增检测、涂片镜检及罗氏培养三种检测方法对胸膜结核患者的胸腔积液进行检测，分析三种方式诊断效能及临床价值，为优化诊断结核性胸膜炎提供参考。现报告如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年9月—2020年9月我院收治的结核性胸腔积液患者98例。（1）纳入标准：符合《临床诊疗指南—结核病分册》诊断标准确诊为结核性胸腔积液的患者。（2）排除标准：①经过超声定位不需要进行胸腔积液穿刺患者；②患有其他心、脑、肾疾病不能抽取积液患者。此次男性患者63例，年龄45～68岁，均龄59岁；女性患者25例，年龄48～64岁，均龄57岁。其中有5例患有HIV。所有患者及家属都知晓并且已经签署了知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂

TL988实时荧光定量PCR仪（西安天隆科技有限公司）、FZP-1核酸提 纯仪（上海仁度生物科技有限公司）；结核分枝杆菌核酸检测（RNA恒温扩增法）试剂盒（上海仁度生物科技有限公司）；ABI7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）,结核分枝杆菌核酸检测（PCR-荧光法）,罗氏固体培养基和对硝基苯甲酸（p-Nitrobenzoic acid, PNB）培养基（珠海银科医学工程有限公司）。

1.3 标本处理

根据标本标识程序SOP进行样本编号，严格按照《结核病诊断细菌学检查规程》对98例患者的标本进行操作[4]，采用NaOH-乙酰半胱胺氨酸法对标本进行固定，去上清，离心的沉淀物加入0.9%氯化钠溶液悬浮。

1.3.1 PCR用移液枪取5 mL样本放入试管中，在试管中加入4%氢氧化钠溶液20 mL，缓慢摇动直至均匀，在室温下把试管放置30 min，取1.0 mL的液体，再进一步用离心机进行离心分离，经15 000 r/min离心后。去上清，然后沉淀，沉淀中加入无菌0.9%氯化钠溶液1 mL，再以15 000 r/min离心5 min,再进行重复沉淀，其中，要再加入DNA提取液摇匀，经10 000 r/min离心5 min，将上清液去除后进行PCR反应，记录检测结果。取1.0 mL的样本放入试管中，用离心机经15 000 r/min离心后。去上清，沉淀加入50微升DNA提取液充分混匀，沸水浴10 min。10 000 r/min离心5 min，取上清液2微升做PCR反应，记录检测结果。

1.3.2 涂片镜检 用移液枪取5 mL,用离心机离心15 min，去上清，加入两倍的氢氧化钠处理，涡旋振荡，沉淀30 min后，加入pH 6.8的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）至50 mL，再次离心，去上清，沉淀物中加入1 mL PBS混匀。然后吸取0.1 mL混匀，沉淀涂在玻片正面的中心处，将标本固定好，然后涂抹成圆形或者椭圆形，再用火的外焰固定，抗酸染色镜检。

1.4 观察指标

以试剂盒自带的阴性、阳性对照作为质控记录基因扩增阳性结果；观察涂片在显微镜下是否呈现出红色，并记录阳性反应；培养基内若满8周仍无细菌生长，即报告培养阴性。

1.5 统计学方法

数据采用SPSS 22.0统计软件进行分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 三种方法检测TPE结果

基因扩增法阳性率56.12%，涂片镜检阳性率29.59%，罗氏培养阳性率25.51%，三组方法检测TPE阳性率结果差异有显著意义，见表1。

表1 三种方法检测TPE阳性率的两两比较[n（%）]

3.讨论

胸腔积液疾病的致病原因中10%～30%为结核性胸膜炎，结核性胸膜炎占到肺结核病的大多数[5]，其诊断通常依靠胸部穿刺取得胸水鉴别诊断或是胸膜切片以获取病理学[6]或细菌学证据。结核性胸膜炎实验室诊断主要的病原学诊断，包括快速培养、痰涂片抗酸染色、结核DNA等方法，但由于胸膜腔的无菌性特征，其涂片和培养的阳性率都很低检查的阳性率均不高，而且特异性较差。目前大多数病例还是通过临床症状和胸水积液常规检查进行诊断。但是对于结核性胸膜炎患者而言，越早确定诊断，不仅对患者的治疗和管理有很大的帮助，而且对公共健康和流行病学具有重要意义。胸腔积液Xpert MTB/RIF检测和γ-干扰素释放分析试验均为近年来试用于临床的新的结核性胸膜炎检测方法，不仅有助于对结核病患者的早期快速诊断，而且还能快速测定结核耐药基因（如Gene Xpert MTB/RIF），对于肺结核具有较高的诊断价值[7-8]，被WHO首要推荐用于结核病诊断。然而对于胸腔这种处于无菌体腔的环境中的体腔，有文献报道病原学诊断如培养和GeneXpert MTB/RIF等检出率均不高，但是病原学阴性的胸腔积液并不意味着就排除结核性胸膜炎，临床上尚有很多病原学阴性的病例[9]。有研究显示对结核疾病的早期诊断和筛查，临床上多采用联合检测能在早期提示诊断，显著提高阳性检出率，并且应用联合检测还可减少肺结核疾病的漏诊率[6]。因此，本文从临床确诊的98例结核性胸腔积液入手，采用基因扩增检测、涂片镜检及罗氏培养三种检测方法对胸膜结核患者的胸腔积液进行检测，评价三种方法对TPE的诊断效能为结核性胸膜炎早期诊断提供特异、灵敏的检测方法。

结果显示，基因扩增法阳性率56.12%，涂片镜检阳性率29.60%，罗氏培养阳性率25.51%，三种方法检测TPE阳性率结果差异有显著意义（P＜0.05）。基因扩增检测法阳性率高于涂片镜检法，差异有显著意义（P＜0.05），基因扩增检测法与罗氏培养阳性率比较，差异有显著意义（P＜0.05），虽然涂片镜检检测者阳性率高于罗氏培养，但差异无统计学意义（P＞0.05）。观察结果我们可以发现，基因扩增检测法对于结核性胸膜炎的诊断和鉴别具有十分重要的作用，尤其需要进行胸腔积液穿刺缓解症状的患者和一些涂片阴性肺结核的患者，可以满足日常医生对肺结核的快速诊断，相比较其他的方法具有特异性强和敏感度高的优点。

分析涂片抗酸杆菌阴性而基因扩增和培养阳性的病例时，发现应用涂片抗酸杆菌镜检比较难以检测出阳性反应，因为在抗酸染色时标本难易固定。即使在实验过程中进行了一系列严格操作降低了假阴性率，观察时还可能因为镜检不够仔细而观察不到分枝杆菌造成标本的漏诊。所以把涂片抗酸杆菌镜检阳性作为临床治疗的依据，会使一些没有痊愈的患者对疗效的判断出现误差，也会造成患者不规律用药，降低患者依从性，从而也会让结核杆菌对普通的药物产生耐药性[10]。罗氏培养法虽然也可以在临床上使用，但是，对于一些要求快速诊断的结核病患者难以满足临床需求且操作难度比较大。发现采用罗氏培养的胸腔积液的阳性率最低，也从中验证了细菌难易透过胸膜进入胸腔中，所以胸腔积液细菌含量少的说法。基因扩增检测法的检出率要高于涂片和罗氏培养法，对于一些菌阴肺结核可以发挥出更大的诊断作用，确保不遗漏有传染性的肺结核患者。对于胸腔积液患者可以反映出结核杆菌数量的多少，也有助于临床上用药的选择。

综上所述，对比涂片镜检和罗氏培养法，基因扩增检测法对结核性胸腔积液的诊断方面具有十分重要的作用，值得我们在临床中应用。