QuEChERS-GC-MS/MS测定化橘红65种农药残留△

熊颖，李纯，侯惠婵，顾利红，栗建明，王艳慧

1.广州市药品检验所/国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，广东 广州 510160； 2.广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663

化橘红为芸香科植物化州柚Citrusgrandis′Tomentosa′或柚C.grandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，理气宽中、燥湿化痰，用于咳嗽痰多、食积伤酒、呕恶疲闷[1]。前者习称“毛橘红”，后者习称“光橘红”“光七爪”“光五爪”。化橘红药用历史悠久，已有1500多年的种植历史。化州柚是广东省化州市特有树种，其未成熟果外果皮即作为化橘红入药，习称化橘红，作为“中国四大南药”及“十大广药”之一，曾被列为皇室专用祛痰圣药[2-3]。近年来，化橘红越来越受到中医药界的重视。随着化橘红需求的增加、种植面积的扩大，病虫害问题日益突出，农药使用和农药残留的问题也日益凸显[4-5]。为调查化橘红农药使用和农药残留的状况，本研究采用固相分散萃取-气相色谱-三重四极杆串联质谱法(QuEChERS-GC-MS/MS)对27批化橘红中65种农药残留进行了检测，以期为道地药材化橘红农药残留限度标准的制定提供参考。

1 材料

1.1 仪器

7890A型气相色谱-7000B型三重四极杆串联质谱仪(美国Agilent公司)；AG245型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；T18型匀浆仪(德国IKA公司)；ST16型高速离心机(美国Thermo公司)；N1000S-WA型旋转薄膜蒸发器(日本EYELA公司)。

1.2 试药

65种农药对照品均购于上海安谱科技公司，纯度均大于99.0%；乙腈(农残级，批号：152667，美国赛默飞公司)；丙酮(农残级，批号：150835，美国赛默飞公司)；氯化钠(农残级，批号U5780025)、内标物磷酸三苯酯(TPP，批号：U900921)均购于上海安谱公司；QuEChERS净化管[无水硫酸镁1200 mg、N-丙基乙二胺(PSA)300 mg、十八烷基硅烷键合硅胶100 mg，批号：9301826，北京迪马科技公司]。

27批化橘红样品经广州市药品检验所侯惠婵主任中药师鉴定，H1～H17为化州柚Citrusgrandis′Tomentosa′的未成熟或近成熟的干燥外层果皮、H18～H27为柚C.grandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，样品信息见表1。空白样品采用未检出待测65种农药残留的化橘红。

表1 化橘红样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent DB-17MS毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气为氦气(纯度：99.999%)；恒压模式，压力146 kPa；进样口温度为250 ℃；进样量为1 μL；不分流进样；程序升温(0～1 min，60 ℃；以30 ℃·min-1升至120 ℃；以10 ℃·min-1升至160 ℃；以2 ℃·min-1升至230℃；以15 ℃·min-1升至300 ℃，保持6 min；升至310 ℃，保持5 min)；传输接口温度为280 ℃。质谱离子源温度为280 ℃；电离模式为电子轰击离子源(EI)；轰击能量为70 eV；碰撞气氮气(纯度：99.999%)；溶剂延迟时间为3.75 min；质谱监测模式为多反应监测(MRM)。优化后的各离子对质谱参数见表2。

表2 65种农药残留QuEChERS-GC-MS/MS分析参数

续表2

2.2 对照品溶液及内标溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备 根据对照品质谱上的响应丰度值确定其在混合对照品溶液中的浓度，乙腈定容，贮藏在-30 ℃冰箱中备用。

2.2.2内标溶液的制备 取TPP适量，精密称定，乙腈配制成0.2 μg·mL-1的溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1提取 取化橘红样品粉碎，过三号筛，取粉末约5 g，精密称定，置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入氯化钠1 g、乙腈30 mL，匀浆提取，12 000 r·min-1离心3 min(离心半径为7 cm)，提取2次，合并上清液，40 ℃水浴旋蒸浓缩，残渣用乙腈洗涤，定量转移至10 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，作为供试品提取液。

2.3.2净化 精密量取供试品提取液5 mL，置QuEChERS净化管中，涡旋使充分混匀，再置振荡器上剧烈振荡(500次/min)5 min使净化完全，4000 r·min-1离心5 min(离心半径为7 cm)，取上清液，即得。

2.4 空白基质溶液的制备

取空白样品粉末约10 g，精密称定，置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，按2.3项下方法制备空白基质溶液。

2.5 基质混合标准溶液的制备

精密吸取混合对照品溶液适量，加空白基质溶液，配制成梯度浓度的基质混合标准溶液(现配现用)。

2.6 样品测定

分别精密量取各浓度基质混合标准溶液及供试品溶液各1.0 mL，精密加入内标溶液0.2 mL，混匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，注入气相色谱仪，测得峰面积，代入随行标准曲线，用内标法计算。

2.7 方法学考察

2.7.1精密度试验 取10 ng·mL-1基质混合标准溶液，连续进样6次，计算精密度，结果RSD均小于10%(表3)，符合痕量分析要求。

表3 化橘红65种农药线性范围、LOQ、加样回收率及精密度

续表3

2.7.2标准曲线与检出限(LOQ) 取不同质量浓度的基质混合标准溶液，注入仪器，绘制标准曲线。结果表明，对照品线性关系良好，相关系数(r)均大于0.995。取标准曲线最低点计算LOQ，LOQ为0.002～0.010 mg·kg-1(表3)。

2.7.3加样回收率试验 取化橘红空白样品粉末5 g，加入不同量的混合对照品溶液，按2.3、2.6项下方法制备供试品溶液并测定。如表3所示，添加水平为0.01 mg·kg-1时平均加样回收率为70.63%～127.65%，RSD为0.97%～8.85%；添加水平为0.01 mg·kg-1时平均加样回收率为67.05%～130.26%，RSD为0.52%～5.27%，符合痕量分析要求。

2.8 样品测定

对样品进行测定，检出禁用农药3种，分别为氟虫腈(H25号样品0.010 0 mg·kg-1)、氟虫腈亚砜(H25号样品0.016 9 mg·kg-1)、甲基异柳磷(H26号样品0.004 2 mg·kg-1)。检出常用限用农药10种，分别为甲氰菊酯(H6号样品2.283 5 mg·kg-1；H7号样品2.627 5 mg·kg-1；H8号样品0.799 8 mg·kg-1；H9号样品2.010 8 mg·kg-1；H10号样品1.248 2 mg·kg-1；H11号样品0.702 1 mg·kg-1；H12号样品0.524 6 mg·kg-1；H13号样品0.359 4 mg·kg-1；H14号样品1.109 7 mg·kg-1；H15号样品0.620 7 mg·kg-1；H16号样品0.601 3 mg·kg-1；H17号样品0.623 3 mg·kg-1；H18号样品0.031 5 mg·kg-1；H22号样品0.012 3 mg·kg-1；H23号样品0.012 9 mg·kg-1；H26号样品0.015 3 mg·kg-1；H27号样品0.016 1 mg·kg-1)、毒死蜱(H24号样品0.012 4 mg·kg-1；H25号样品0.020 5 mg·kg-1；H26号样品0.290 7 mg·kg-1)、氯氰菊酯(H25号样品0.115 3 mg·kg-1；H26号样品0.100 1 mg·kg-1)、反式氯丹(H17号样品0.009 2 mg·kg-1)、顺式氯丹(H17号样品0.009 0 mg·kg-1)、三唑酮(H26号样品0.005 4 mg·kg-1)、丙溴磷(H26号样品0.013 8 mg·kg-1)、三唑醇(H26号样品0.017 8 mg·kg-1)、三唑磷(H26号样品0.012 1 mg·kg-1)、三氟氯氰菊酯(H26号样品0.017 2 mg·kg-1)。

3 讨论

中药提取物成分复杂，为了降低色谱柱、离子源等污染，提高仪器灵敏度和稳定性等性能，有必要对提取液进行净化。农药残留检测的常用净化方式有QuEChERS、固相萃取、液液萃取、凝胶渗透色谱、磺化法等[6-17]。课题组前期已用固相萃取(SPE)法对另20批化橘红进行了农药残留检测[6]，本实验采用QuEChERS净化管(无水硫酸镁1200 mg、N-丙基乙二胺300 mg、十八烷基硅烷键合硅胶100 mg)净化。

液相质谱基质效应的主要原因是待测组分与样品中的基质成分在雾滴表面离子化过程的竞争；气相色谱中基质效应在于活性位点样品中的基质组分与目标分析物分子竞争，竞争结果会让目标离子的生产效率以及离子强度出现降低或者增加，这会使最终测定结果的精密度以及准确度受到影响[18-19]。基质效应在痕量质谱分析中广泛存在，为提高分析结果的准确性，要考虑基质效应。改善基质效应方法有空白基质匹配标准溶液、样品净化、同位素内标、分析保护剂、优化色谱和质谱条件、样品加标回收校正等[20]。化橘红中含有黄酮类、香豆素类和挥发油等多种成分，基质增强效应明显，本实验采用空白基质匹配标准溶液、样品QuEChERS净化和优化色谱、质谱条件改善基质效应。

样品测定结果分析，2批光橘红检出禁用农药3种，毛橘红未检出禁用农药。1批毛橘红检出氯丹，光橘红检出常用限用农药较多。毛橘红的农药残留情况稍好。总体来看，本次27批化橘红检出的农药用途均为杀虫、杀菌。甲氰菊酯使用率较高。除个别批次外，样品中农药检出品种不多，部分样品检出禁用农药和常用限用农药，其种植过程中农药使用情况要注意。为保证化橘红品质，建议有关部门加强化橘红种植过程中的科学引导，完善化橘红种植规范，加强外源性风险管控力度，合理使用低毒农药，避免禁、限用农药污染风险。