脂联素通过Nrf2/HO-1通路对急性心肌梗死大鼠心功能和心肌细胞凋亡的作用机制

郭施勉，楚英杰

冠状动脉急性闭塞导致的心肌缺血在临床中被称为急性心肌梗死(AMI)[1-3]，通常病人临床症状为心源性休克、心律失常，严重者可出现猝死。AMI重要病理环节是心肌缺血缺氧、氧化应激反应过度激活，这一过程中包括很多生物学环节，而过度激活核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧化酶1(HO-1)通路就是心肌缺血缺氧、氧化应激反应过度的表现之一[4-6]。Nrf2/HO-1通路参与了细胞内抗氧化应激的信号通路，在一定条件下，使Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白(Keap)1和Nrf2结合受到抑制。在过度激活氧化应激的条件下，氧自由基可以调控Nrf2蛋白表达增多和Keap1解离，从而调控HO-1基因序列上的启动基因和抗氧化反应元件表达并发挥抗氧化的影响。脂联素(APN)是一种内源性激素，是由脂肪细胞分泌的一种具有促进脂肪和葡萄糖分解代谢功能的蛋白质[6-8]，其对降低胰岛素抵抗、提高机体胰岛素敏感度有着积极的作用。有研究证明，在胰岛素抵抗状态的作用下，葡萄糖分解代谢功能出现障碍，导致心肌细胞脂肪酸氧化失常，心肌细胞凋亡率急剧增加，这时会出现心脏收缩障碍[9-11]。尽管近年来有很多研究均证实了APN与心肌细胞凋亡有相关性，但是APN是否通过干扰Nrf2/HO-1通路对AMI病人心肌细胞凋亡起作用及其作用机制鲜见报道。本研究旨在探讨APN通过Nrf2/HO-1通路对AMI大鼠心功能和心肌细胞凋亡的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠购自广东省医学实验动物中心；锌原卟啉 9(ZPP-Ⅸ)购自Meilunbio；原位末端标记测定法(TUNEL)染色试剂盒及磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、磷酸肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自美国 Biomiga公司；第一链 cDNA合成试剂盒和RNA提取试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Nrf2、HO-1、B淋巴细胞瘤 2 蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关 X 蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)的一抗购自Santa Cruz公司；凝胶成像仪和PCR仪购自Bio-Rad 公司；荧光显微镜购自Nikon公司；分光光度计购自上海精密仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 将健康成年雄性SD大鼠随机分为Sham 组、AMI组、APN组和APN+ZPP-Ⅸ组，Sham 组不做任何处理，AMI组、APN组和APN+ZPP-Ⅸ组均建立AMI模型(方法：左冠状动脉前降支结扎)。

1.2.2 建模 腹腔注射10%水合氯醛10 mL/kg麻醉后将大鼠仰卧放置于手术操作台，在大鼠的左侧第3肋、第4肋间作切口，切开后显露心脏，然后分离左冠状动脉前降支，缝合左冠状动脉前降支的起始部位，然后关闭腹腔，建模成功。

1.2.3 给药方法 建模后，APN组给予腹腔注射1mg/(kg·d)APN，APN+ZPP-Ⅸ组给予腹腔注射1 mg/(kg·d)APN和10 μmol/(kg·d) ZPP-Ⅸ，Sham 组和AMI组腹腔注射同等剂量的生理盐水，连续注射7 d。

1.2.4 心脏氯化三苯基四氮唑(TTC)染色 最后1次给药24 h后，在Sham 组、AMI组、APN组和APN+ZPP-Ⅸ组各选择2只大鼠，摘取其心脏后放入-20 ℃的环境下冰冻，1 h后取出，沿着心脏长轴以心尖向心室基底部开始横向切心肌组织5片，将5片心肌组织使用1% TTC进行染色，20 min后使用4%多聚甲醛固定10 min。拍照，灰白色为缺血心肌组织，红色为正常心肌组织，使用Image J 软件分析心肌缺血面积。

1.2.5 血清心肌酶检测 建模24 h后，取大鼠的眼内眦血液，然后将其静置30 min后进行离心处理，取上清液，使用分光光度试剂盒检测LDH、CK-MB、CK含量。

1.2.6 心肌细胞凋亡检测 最后1次给药24 h后，解剖大鼠心脏，将梗死的心肌组织分离，使用4%多聚甲醛固定后实施石蜡包埋，将心肌组织制成切片后使用TUNEL试剂盒进行染色。在显微镜下蓝色荧光为细胞核，绿色荧光为凋亡细胞，计算心肌细胞凋亡率。

1.2.7 mRNA表达水平检测 获取梗死的心肌组织，使用RNA提取试剂盒将梗死心肌组织的RNA进行分离，然后将RNA合成cDNA。在扩增条件下，使用荧光定量PCR试剂盒进行cDNA扩增，连续循环40次，得出循环阈值。用β-actin作内参，根据循环阈值计算mRNA的表达水平。

1.2.8 基因蛋白表达检测 将RIPA裂解液放入梗死部位心肌组织中，提取梗死部位心肌组织总蛋白后实施定量。每组蛋白选择50 μg，然后使用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测。在聚丙烯酰胺凝胶中加入蛋白样本进行电泳和电转膜后加入5%的脱脂牛奶，将其放入温室中培养2 h，取出使用TBST进行洗膜，连续清洗3遍。将Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3的一抗加入。在4 ℃条件下培养12 h后，使用TBST进行洗膜，连续清洗3遍，放入温室中培养2 h，使用凝胶成像仪得到蛋白条带，用β-actin作内参，根据蛋白条带计算基因蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 4组大鼠血清心肌酶含量比较 Sham 组血清LDH、CK-MB、CK含量明显低于AMI组，AMI组血清LDH、CK-MB、CK含量明显高于APN组，APN组LDH、CK-MB、CK含量明显低于APN+ZPP-Ⅸ组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 4组大鼠血清心肌酶含量比较(±s) 单位：U/L

2.2 4组大鼠缺血心肌面积比较 与Sham 组比较，AMI组大鼠明显有心肌缺血，且APN组大鼠心肌缺血面积明显小于AMI组，APN+ZPP-Ⅸ组大鼠心肌缺血面积明显大于APN组。详见图1。

图1 心肌组织TTC染色图

2.3 4组大鼠心肌细胞凋亡率比较 AMI组心肌细胞凋亡率明显高于Sham 组，APN组心肌细胞凋亡率明显低于AMI组，APN+ZPP-Ⅸ组心肌细胞凋亡率明显高于APN组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图2、图3。

图2 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡

与Sham组比较，＊ P<0.05；与AMI组比较，# P<0.05；与APN组比较，△ P<0.05。

2.4 4组大鼠心肌组织中凋亡基因mRNA及蛋白表达水平比较 AMI组心肌中Bcl-2表达明显低于Sham组，且Cleaved-caspase-3和Bax表达明显高于Sham组；APN组心肌中Bcl-2表达明显高于AMI组，且Cleaved-caspase-3和Bax表达明显低于AMI组；APN+ZPP-Ⅸ组心肌中Bcl-2表达明显低于APN组，且Cleaved-caspase-3和Bax表达明显高于APN组；差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图4、图5。

与Sham组比较，＊ P<0.05；与AMI组比较，# P<0.05；与APN组比较，△ P<0.05。

2.5 4组大鼠心肌组织中Nrf2、HO-1表达水平比较 AMI组心肌中Nrf2、HO-1表达水平明显高于Sham组，APN组心肌中Nrf2、HO-1表达水平明显高于AMI组，差异均有统计学意义(P<0.05)；APN+ZPP-Ⅸ组心肌中Nrf2表达水平与APN组比较差异无统计学意义(P>0.05)，APN+ZPP-Ⅸ组心肌中HO-1表达水平明显低于APN组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图6、图7。

与Sham组比较，＊ P<0.05；与AMI组比较，# P<0.05；与APN组比较，△ P<0.05。

与Sham组比较，＊ P<0.05；与AMI组比较，# P<0.05；与APN组比较，△ P<0.05。

3 讨 论

AMI是临床中最为严重的冠心病[12-14]。近年来AMI病人逐年递增，具有较高的发病率和死亡率，严重影响人们的生命安全。AMI病理基础是不稳定斑块破裂，其始动原因为血管内皮细胞受损，而血管内皮细胞受损主要标志就是血管内皮细胞蛋白C受体[15-17]。APN是一种新型内源性生物蛋白质，其具有抗炎症、抗动脉粥样硬化和抗损伤后内膜增生的活性[18]。相关报道指出，APN与冠心病等心血管疾病的发生、发展有一定的相关性[19]。近年来，APN在心血管疾病发病过程中的影响已成为研究热点。舒海洲等[20]研究发现，APN与AMI的发生发展有关，且APN还能影响AMI的预后。

本研究将APN运用到AMI治疗中，通过建立AMI大鼠模型，检测血清心肌酶水平的变化，结果发现，Sham 组血清LDH、CK-MB、CK含量明显低于AMI组，AMI组血清LDH、CK-MB、CK含量明显高于APN组，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明APN对于减轻心肌损伤程度有积极的作用。

AMI发生后心肌细胞出现损伤是线粒体途径细胞凋亡的重要环节，随着抗凋亡分子Bcl-2不断减少，促凋亡分子Bax逐渐增多，导致线粒体内的细胞色素C大量进入细胞质，通过相关反应使Pro-caspase-3被裂解成Cleaved-caspase-3促使细胞凋亡。本研究发现，AMI组心肌中Bcl-2表达明显低于Sham组，且Cleaved-caspase-3和Bax表达明显高于Sham组，差异均有统计学意义(P<0.05)，进一步说明在AMI大鼠中线粒体途径细胞凋亡被过度激活，造成Bcl-2表达水平过低，Cleaved-caspase-3和Bax表达水平明显升高。吴霞等[21]研究发现，APN在心肌细胞中具有抗凋亡的作用。本研究将APN用于AMI模型大鼠中，结果发现，APN组大鼠心肌中Bcl-2表达明显高于AMI组，且Cleaved-caspase-3和Bax表达明显低于AMI组，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明APN可以抑制AMI大鼠细胞凋亡。

有相关报道指出，在AMI细胞凋亡发生和发展过程中受到炎症介质、缺血缺氧、氧自由基等多种病理因子的调控，在缺血缺氧的条件下Nrf2/HO-1通路在心肌中发挥了重要的调控作用[22-23]。本研究发现，AMI组大鼠心肌中Nrf2、HO-1表达水平明显高于Sham组，APN组大鼠心肌中Nrf2、HO-1表达水平明显高于AMI组，差异均有统计学意义(P<0.05)。说明APN可以有效刺激Nrf2/HO-1通路起到抗氧化、抗凋亡的作用。为了进一步证实APN是否通过Nrf2/HO-1通路对心肌起保护作用，本研究采用抑制ZPP-Ⅸ来抑制APN对Nrf2/HO-1通路的激活作用，结果发现，APN组LDH、CK-MB、CK、心肌细胞凋亡率、心肌中Bax和Cleaved-caspase表达水平明显低于APN+ZPP-Ⅸ组，差异均有统计学意义(P<0.05)；APN组心肌中的Bcl-2表达水平明显高于APN+ZPP-Ⅸ组，差异有统计学意义(P<0.05)，证明APN通过刺激Nrf2/HO-1通路来对AMI大鼠心肌起保护作用。

综上所述，APN在AMI模型大鼠中具有抑制心肌细胞凋亡、减轻心肌受损的作用，APN保护心肌作用的分子机制为Nrf2/HO-1通路。