黄芩苷对人结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

张淑华，官学苹，阮奇军，周桂海，郑银海，迟宏罡，2

(1. 广东医科大学第二临床医学院，广东 东莞 523000；2. 广东医科大学附属东莞第一医院，广东 东莞 523000)

结肠癌的发生与多种原因有关，包括结肠前期病变、家族性遗传、环境影响等[1]。目前结肠癌的治疗方式有手术切除、化疗、放疗、免疫疗法等多种西医治疗手段，有较好疗效，但存在切除不彻底、对正常细胞损伤大等问题[2]。中医药具有廉价、低毒、种类多等特点，在开发有效的药物治疗结肠癌方面具有广阔的前景。从中医角度看，结肠癌是由正虚感邪、内伤饮食及情志失调引起的，以湿热、瘀毒蕴结于肠道，传导失司为基本病机的一种恶性疾病[3]。在众多的中医方剂当中，黄芩汤在治疗大肠癌方面具有一定的优势[4]。黄芩汤出自《伤寒论·辨太阳病脉证并治》, 由黄芩、芍药、炙甘草和大枣组成，为清热止利、和中止痛常用之方。黄芩汤的君药为黄芩，含有多种化学成分，黄芩苷为其主要成分之一，有抗肿瘤作用[5]，但其作用靶点和具体机制尚不明确。本实验运用公认用于结肠癌研究的人结肠癌SW480细胞，基于与细胞增殖失控和细胞凋亡抑制相关的STAT3/Bcl-2通路，研究了黄芩苷对人结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响，初步探讨黄芩苷防治结肠癌的效应机制，揭示其作用靶点。

1 实验材料与方法

1.1细胞株 人结肠癌SW480细胞株，来自广东医科大学临床医学院科研平台。

1.2主要仪器 超纯水系统(德国USF EIGA公司)，电子分析天平(德国Sartorius公司)，高速低温离心机(德国Eppendorf公司)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)，可调式微量移液器(德国Brand公司)，-80 ℃低温冰箱(德国Thermo公司)，二列机智能水浴ZKSY-1(巩义市予华仪器有限责任公司)，超净工作台(美国Thermo公司)，二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo公司)，细胞培养板(美国Corning公司)，96孔培养板(美国Corning-Coster公司)，多功能酶标仪(美国BioTEK公司)，EVOS FL Auto显微镜细胞成像系统(美国Life Technologies)，流式细胞仪(美国BD公司)，稳压稳流电泳仪(美国Bio-RAD公司)，电泳槽(美国Bio-RAD公司)，转膜装置(美国Bio-RAD公司)，摇床(广州沃德生物有限公司)，Azure C500成像系统(美国Azure Biosystems公司)。

1.3主要试剂 Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(美国Becton Dickinson公司)，PVDF膜(Millipore公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光显色液(德国Thermo公司)，IP细胞裂解液(江苏碧云天生物技术研究所)，磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂(上海贝博生物)，Edu细胞增殖检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，Cell Counting Kit-8试剂盒(日本同仁化学)， 兔抗人Bcl-2多克隆抗体、兔抗人Bax多克隆抗体、鼠抗人Caspase-3单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体、鼠抗人STAT3单克隆抗体、羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗、蛋白Mark(美国Cell Signaling Technology公司)，10% SDS-PAGE凝胶(Solarbio公司)，胎牛血清(Gibco公司)，Gibco RPMI 1640培养基、0.25%胰蛋白酶(美国赛默飞世尔科技)，PBS缓冲溶液(武汉博士德生物工程公司)，Tween-20(上海华顺公司)，脱脂牛奶(碧迪医疗器械有限公司)，黄芩苷(纯度98%，分子量446.36，购自中国食品药品检定研究所，批号：Y0001273，产地：欧洲药典EP)。

1.4细胞培养及分组

1.4.1细胞培养 将人结肠癌SW480细胞用含10%胎牛血清的Gibco RPMI 1640培养基于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，显微镜下观察细胞生长形态，适时更换培养液，将细胞培养至对数生长期备用。

1.4.2药物配制 称取10.2 mg黄芩苷粉末于1.5 mL EP管内，用100 μL的DMSO使其溶解成105 μg/mL的母液。取母液用Gibco RPMI 1640培养基分别配制成25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL 5个浓度的工作液。

1.4.3实验分组 实验分为6组，空白组用不含黄芩苷Gibco RPMI 1640培养基培养，黄芩苷25，50，100，200，400 μg/mL组采用相应浓度黄芩苷培养。

1.5CCK-8法测SW480细胞增殖情况 取对数生长期的SW480细胞，以每孔3×103细胞接种于96孔板中，置于培养箱中预培养至正常生长阶段，依1.4.3分组处理。在培养箱内培养24 h后，弃去培养基，向每孔加入含10% CCK-8液的培养基，于培养箱中培养1.5 h后，用多功能酶标仪测定在450 nm处的吸光度并进行分析。

1.6Edu检测细胞增殖情况 取对数生长期的SW480细胞，以每孔5×103细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段，依1.4.3分组处理。培养24 h后向每孔加入100 μL的 50 μmol/L Edu培养基(细胞培养基与Edu溶液试剂A比例为1 000∶1)置于培养箱中孵育2 h进行Edu标记。标记后用PBS洗2次(5 min/次)。弃PBS， 加细胞固定液,室温孵育30 min后加入2 mg/mL甘氨酸50 μL摇床孵育5 min，PBS清洗1次，每孔加入100 μL渗透剂(0.5%TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10 min，PBS清洗1次，弃PBS。进行Apollo染色，向每孔加入100 μL的1×Apollo染色反应液，避光，室温，脱色摇床孵育30 min。弃染色反应液，加入100 μL渗透剂(0.5%TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10 min。PBS清洗细胞2次后，进行DNA染色，每孔加入100 μL 1×Hoechst33342反应液(去离子水与Edu溶液试剂F比例为100∶1)，避光，室温，脱色摇床孵育30 min。弃染色反应液，PBS清洗3次，每孔加入100 μL PBS保存。用EVOS FL Auto显微镜细胞成像系统拍照观察。

1.7Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡情况取对数生长期的SW480细胞,以每孔3×105细胞接种于6孔板中，于培养箱中预培养至正常生长阶段，依1.4.3分组处理。作用24 h后收集细胞与培养基，1 500 r/min离心5 min，弃培养基，用PBS洗细胞2次，1 500 r/min离心5 min，弃PBS。向离心后的细胞中加入500 μL的Binding Buffer使细胞呈悬浮态，依次往其中加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI混合均匀，避光，室温反应5～15 min，在1 h内用流式细胞仪检测。

1.8Western blot法检测增殖凋亡相关蛋白表达情况 取对数生长期的SW480细胞，以每孔3×105细胞接种于6孔板中，于培养箱中预培养至正常生长阶段，依1.4.3分组处理，作用24 h后提取总蛋白。弃去培养液，用4 ℃预冷的PBS缓冲溶液清洗细胞后，加入100 μL的细胞快速裂解液(细胞PI裂解液、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂比例为100∶1∶1)反应15 min。刮取细胞移至1.5 mL离心管中，于4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上清，往其中加入1/5体积的6×蛋白上样缓冲溶液，沸水中煮5 min后，1 200 r/min离心15 min，置于-20 ℃冰箱中备用。依照BCA试剂盒说明书制备标准品试剂，使用多功能酶标仪于562 nm处测量吸光值，根据得到的数据制备BSA蛋白浓度标准曲线，得蛋白浓度计算方程。取制备好的蛋白样品，根据测得浓度计算蛋白上样体积，使用10% SDS-PAGE凝胶分离蛋白。250 mA恒流120 min条件下，湿法蛋白转移到PVDF膜上。将PVDF膜置于5%脱脂牛奶中室温慢摇封闭2 h。用1×PBST置于摇床上快摇洗3次/10 min后，将膜浸泡于兔抗人Bcl-2、Bax多克隆抗体及鼠抗人Caspase-3、β-actin、STAT-3单克隆抗体中(抗体与一抗稀释剂比例为1∶10 000)，在4 ℃慢摇孵育过夜。取出用1×PBST洗3次/10 min，放入对应的二抗(二抗抗体与二抗稀释剂比例为1∶100 000)中避光4 ℃慢摇孵育2 h，PBST洗3次/10 min。避光条件下配置适量发光工作液(A液与B液比例为1∶1)，发光显影，使用Azure C600成像仪拍照成像。运用Image J分析条带灰度值。目的蛋白的相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白(β-actin)灰度值。

2 结 果

2.1各组人结肠癌SW480细胞增殖情况 空白组和黄芩苷25，50，100，200，400 μg/mL组细胞增殖率分别为(97.00±0.02)%、(95.68±0.02)%、(93.30±0.01)%、(92.70±0.02)%、(91.35±0.01)%、(64.85±0.02)%。黄芩苷各组的细胞增殖率均明显低于空白组(P均<0.05)，且随着黄芩苷浓度的增高而缓慢下降，当浓度达400 μg/mL时，细胞增殖率显著下降1/4。Edu染色表现见图1。

2.2各组人结肠癌SW480细胞凋亡情况 空白组早期细胞凋亡率为7.2%，中期凋亡率为14.1%；黄芩苷25，50，100，200，400 μg/mL组早期细胞凋亡率分别为0.6%，2.0%，1.5%，5.1%，5.1%；中期细胞凋亡率分别为2.0%，2.4%，2.3%，8.2%，6.4%。人结肠癌SW480细胞凋亡率有随着黄芩苷浓度增高而逐渐升高的趋势。

图1 各组人结肠癌SW480细胞Edu染色表现(×400)

2.3各组人结肠癌SW480细胞中增殖凋亡相关蛋白表达情况 随着黄芩苷浓度的增高，Bax蛋白表达量逐渐增加，黄芩苷100，200，400 μg/mL组明显高于空白组(P均<0.05)，黄芩苷200 μg/mL和400 μg/mL组比较差异无统计学意义(P>0.05)；Bcl-2和STAT-3蛋白表达量逐渐降低,黄芩苷50，100，200，400 μg/mL组均明显低于空白组(P均<0.05)；黄芩苷50，100，200，400 μg/mL组Caspase-3蛋白表达量呈下降趋势，但与空白组比较及各浓度组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2及图3。

3 讨 论

黄芩苷是一种黄酮苷类化合物，主要来源于黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的根。前期研究表明，黄芩苷具有抗肿瘤、抗炎、保护脑损伤及肝肺功能、抗病毒等作用[6]，其可促进小鼠结肠癌CT26.WT细胞凋亡,可使RIP3基因和蛋白表达明显上调[7]。

1为空白组；2为黄芩苷25 μg/mL组；3为黄芩苷50 μg/mL组；4为黄芩苷100 μg/mL组；5为黄芩苷200 μg/mL组；6为黄芩苷400 μg/mL组图2 各组人结肠癌SW480细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、STAT-3蛋白表达条带图

本实验观察了不同浓度黄芩苷对人结肠癌肿瘤细胞增殖和凋亡的影响，CCK-8结果显示黄芩苷对结肠癌细胞的增殖有抑制作用，其抑制作用随着浓度的增高而增强，与文献[8-9]研究报道相同。但是本实验中黄芩苷浓度为25,50,100,200 μg/mL时对细胞增殖的抑制作用随着浓度的增高而缓慢下降，当黄芩苷浓度达400 μg/mL时对细胞增殖的抑制作用显著下降1/4,不排除实验误差对本实验结果造成影响。Edu染色结果显示黄芩苷浓度达400 μg/mL时细胞增殖显著减少，进一步证实黄芩苷对结肠癌细胞的增殖有抑制作用。细胞凋亡检测结果显示，黄芩苷有促进人结肠癌SW480细胞凋亡的作用，但各浓度组未显示有差异，可能是因为用于流式细胞仪检测的细胞数量过少而造成，也可能与药物本身药理效应较弱有关。

1为空白组；2为黄芩苷25 μg/mL组；3为黄芩苷50 μg/mL组；4为黄芩苷100 μg/mL组；5为黄芩苷200 μg/mL组；6为黄芩苷400 μg/mL组图3 各组人结肠癌SW480细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、STAT-3蛋白表达情况

STAT3是信号转导和转录激活因子(STAT)家族成员之一，由许多细胞因子、生长因子和癌基因下游的YP标准化激活[10-11]，其是细胞核中几种凋亡相关基因的主要转录增强子，是公认的致癌基因及抗癌疗法的良好靶标[12-13]。Bcl-2家族蛋白(包含Bcl-2和Bax)是STAT3下游靶蛋白，活化的STAT3可调节Bcl-2家族蛋白的表达而抑制细胞的增殖并诱导其凋亡[14-15]。Bcl-2家族蛋白是目前研究较为清楚的凋亡相关蛋白，其中Bcl-2蛋白具有抑制凋亡的作用；Bax是促凋亡蛋白，其是内在凋亡信号传导途径的必需组分[16]。Edlich[17]发现Bax的活性由Bcl-2家族内外的复杂蛋白质网络精确控制，Bcl-2可与Bax形成同源的蛋白二聚体，当Bax的表达量相对高于Bcl-2的表达量时，形成促进凋亡的同二聚体，而当Bcl-2的表达量高于Bax的表达量时，则形成抑制凋亡的异二聚体。Caspase-3作为细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分[18]。相关研究表明，Bcl-2家族蛋白可以诱导细胞色素C从线粒体释放，继而激活Caspase[19]。本实验结果显示， 随着黄芩苷浓度的增高，Bcl-2和STAT-3蛋白表达量逐渐降低,黄芩苷50，100，200，400 μg/mL组均明显低于空白组；Bax蛋白表达量逐渐增加，黄芩苷100，200，400 μg/mL组明显高于空白组；且Bax蛋白表达量相对高于Bcl-2蛋白表达量；Caspase-3蛋白表达量与黄芩苷浓度的关系不明显，但其总体表达量高于内参蛋白。上述结果说明黄芩苷可明显抑制STAT3表达，经由STAT3所在信号通路而下调Bcl-2表达，间接导致Bax表达的上调并因此诱导凋亡；黄芩苷可促进Caspase-3所在信号通路的激活，但其与浓度的相关性尚不明了，其是否是通过促进Bax、Bcl-2基因表达而诱导细胞色素C释放，继而激活Caspase还有待进一步研究。

综上所述，黄芩苷可能通过下调STAT-3表达而抑制Bcl-2表达并促进Bax表达来诱导人结肠癌SW480细胞凋亡并抑制其增殖，且呈一定的量效关系。本实验提示黄芩苷可能具有治疗结肠癌的作用，为阐明中药复方黄芩汤治疗结肠癌的药效作用机制提供了科学依据和新认识，为开发黄芩苷作为新型防治结肠癌或辅助手术、放化疗以减轻毒副作用的药物提供了理论支持。但因时间及相关技术条件等限制，未进行动物或人体相关实验，还有待进一步深入研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。