miR-155联合超声对分化型甲状腺癌淋巴结转移的诊断价值分析

许卫国，全江涛，周娟，张智林，廖扬，陈蕊

分化型甲状腺癌是甲状腺癌最常见的类型，约占甲状腺癌的95%，虽然其恶性程度不高，病死率较低，但术后易出现局部复发，严重影响患者的生活质量［1］。淋巴结转移是分化型甲状腺癌患者术后局部复发的重要因素，对于存在颈部淋巴结转移的患者，行颈部淋巴结清扫术已成为临床共识，但易引起甲状旁腺损伤、喉返神经损伤等术后并发症，因此对于术前检查颈部淋巴结转移阴性的患者是否行预防性淋巴结清扫仍存在争议［2］。早期准确地判断分化型甲状腺癌患者是否发生淋巴结转移有利于临床制定治疗方案。超声是临床诊断淋巴结转移最常用的影像学检查手段，但其诊断价值还有待进一步的提高［3］。近年来微小RNA（miRNA，miR）与恶性肿瘤的关系成为临床研究的热点，miR-155 是一种与甲状腺癌密切相关的miRNA。相关研究显示其在甲状腺乳头状癌患者血清中呈异常高表达，且可用于诊断鉴别甲状腺良、恶性病变［4］。目前大量研究证明，miRNA 等生物标志物在诊断恶性肿瘤淋巴结转移领域有一定的应用价值［5-6］。鉴于此，本研究应用miR-155联合超声对分化型甲状腺癌淋巴结转移的诊断价值进行分析，以期为临床诊断提供新的备选生物标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018 年6 月—2020 年4 月在解放军南部战区总医院接受治疗的分化型甲状腺癌患者112例作为甲状腺癌组。纳入标准：（1）经临床病理证实为分化型甲状腺癌［7］。（2）入组前未接受任何形式的抗肿瘤治疗。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤者。（2）分化型甲状腺癌复发者。（3）合并有心、肝、肾功能障碍者。（4）存在血液疾病、免疫系统疾病者。112 例患者中男 30 例，女 82 例，平均年龄（54.81±6.35）岁，淋巴结转移62 例，其中单纯中央区转移19 例，中央区及侧颈转移43 例，无跳跃性转移病例。TNM 分期采用美国癌症联合委员会第8版甲状腺癌分期系统。另选取同期收治的结节性甲状腺肿患者30例作为良性对照组，其中男10例，女20 例，年龄（54.98±6.52）岁。2 组患者的性别（χ2=0.501）、年龄（t=0.130）比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究已通过我院伦理委员会的审批（批准号：2018042），患者及其家属对本研究内容均知情同意。

1.2 超声检查及淋巴结转移判定 采用Pihilips IU22 彩色多普勒超声进行检查，探头频率为5～12 MHz。根据文献以及临床经验观察以下超声征象［8-9］：（1）淋巴结门结构消失。（2）淋巴结长短径比＜2。（3）淋巴结边界不清。（4）淋巴结内团状高回声。（5）淋巴结出现明显融合。（6）淋巴结内出现微钙化或液化。（7）淋巴结门样血流信号。（8）皮质不均匀增厚。以上超声征象中若出现2 个及以上则判定为存在淋巴结转移。

1.3 血清及组织中miR-155 检测 患者入院时抽取空腹静脉血5 mL，3 000 r/min离心10 min后分离血清。患者手术切除的癌组织以及良性病变组织剪碎后加入液氮研磨。采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测血清及组织中miR-155 的相对表达量。组织或血清中加入Trizol 裂解液（美国Invitrogen公司）提取总RNA，采用反转录试剂盒（美国Fermentas公司）进行反转录。以反转录得到的cDNA 为模板进行扩增反应。内参U6 上游引物5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下游引物 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，miR-155 上游引物5'-ACGCTCAGTTAATGCTAATCGTGATA-3'，下游引物5'-ATTCCATGTTGTCCACTGTCTCTG -3'。反应条件：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-155的相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0进行统计分析。计量资料经检验均符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析miR-155和超声对分化型甲状腺癌淋巴结转移的诊断价值。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2 组患者血清及组织中miR-155的相对表达情况 甲状腺癌组的血清及组织中miR-155的相对表达量均明显高于良性对照组（P＜0.01），见表1。

Tab.1 Expression of miR-155 in serum and tissues of patients with differentiated thyroid cancer and benign control group表1 甲状腺癌组及良性对照组患者血清及组织中miR-155的表达情况 （±s）

Tab.1 Expression of miR-155 in serum and tissues of patients with differentiated thyroid cancer and benign control group表1 甲状腺癌组及良性对照组患者血清及组织中miR-155的表达情况 （±s）

＊＊P＜0.01

组别n血清miR-155组织miR-155良性对照组301.02±0.411.68±0.74甲状腺癌组1123.35±1.134.06±1.28 t 11.075＊＊9.741＊＊

2.2 分化型甲状腺癌患者血清及组织中miR-155的表达与临床病理参数的关系 不同性别、年龄、癌灶数量的分化型甲状腺癌患者血清及组织中miR-155的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。有淋巴结转移、肿瘤直径＞2 cm、TNM 分期Ⅲ+Ⅳ期的患者的血清及组织中miR-155的相对表达量分别高于无淋巴结转移、肿瘤直径≤2 cm、TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期的患者（均P＜0.05），见表2。

Tab.2 Relationship between the expression of miR-155 in serum and tissue and clinicopathological parameters in patients with differentiated thyroid cancer表2 分化型甲状腺癌患者血清及组织中miR-155的表达与临床病理参数的关系 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

临床病n血清t组织t理参数miR-155miR-155性别男303.19±0.980.9063.87±1.030.901女823.41±1.194.13±1.45年龄＜55岁473.46±1.220.8914.24±1.541.276≥55岁653.27±1.033.93±1.03淋巴结转移有无65 20 32..96 33± ±10..38 4 75.924＊＊4 3..81 13± ±10..59 6 36.710＊＊癌灶数量多发413.59±1.261.6864.30±1.541.576单发713.21±1.083.92±1.01肿瘤直径＞ ≤22 cc mm 28 66 33..72 53± ±11..20 7 72.077＊4 3..59 80± ±10..49 1 72.798＊＊TNM分期ⅠⅢ++ⅡⅣ期期73 66 34..00 33± ±01..93 1 84.568＊＊3 5..51 62± ±01..95 7 96.412＊＊

2.3 超声以及血清miR-155 对分化型甲状腺癌淋巴结转移的诊断价值 以术后病理结果为金标准，分析超声以及血清miR-155对分化型甲状腺癌淋巴结转移的诊断价值。ROC 结果显示，超声以及血清miR-155对分化型甲状腺癌淋巴结转移均有一定的诊断价值，但漏诊率和误诊率均超过10%；联合应用则可提升诊断价值，漏诊率和误诊率能够降至10%以下。见图1、表3。

Fig.1 ROC curve of ultrasound and serum miR-155 in diagnosing lymph node metastasis of differentiated thyroid cancer图1 超声以及血清miR-155诊断分化型甲状腺癌淋巴结转移的ROC曲线

3 讨论

近年来甲状腺癌的发病率呈上升趋势，尤其以分化型甲状腺癌中的乳头状甲状腺癌最为显著［10］。虽然在早期经过合理治疗后甲状腺癌患者的10 年生存率可达到80%～90%，但每年的死亡病例数仍然居高不下。如何更好地改善患者预后成为临床需要进一步解决的问题。颈部淋巴结转移情况将直接影响到甲状腺癌患者治疗策略的选择，同时也是患者术后复发以及预后不良的重要因素，因此淋巴结转移情况评估一直是术前病情分析的重点。超声是目前临床评估甲状腺癌患者淋巴结转移最常用的方法，其可通过超声征象对患者的病情进行分析，如淋巴结门结构消失、皮质不均匀增厚、淋巴结的边界不规则或模糊、微钙化等。但是，凭借以上超声征象诊断各有局限性，如淋巴结门结构消失的敏感度极高，但特异度差；微钙化的特异度高，但敏感度一般［11］。另一方面，分化型甲状腺癌的淋巴结转移区域主要为颈中央区和颈侧区，由于头颈部解剖结构复杂，锁骨、气管等结构会对超声扫描造成一定的影响，且部分患者存在甲状腺的弥漫性病变，也会对超声结果的判断造成一定干扰［12］。本研究结果也显示，超声诊断分化型甲状腺癌淋巴结转移具有较高的漏诊率和误诊率，分别为16.13%和16.00%，因此选取合适的生物标志物辅助超声诊断，对准确评估病情、改善患者预后有重要的意义。

Tab.3 Diagnostic value of ultrasound and serum miR-155 in lymph node metastasis of differentiated thyroid cancer表3 超声以及血清miR-155对分化型甲状腺癌淋巴结转移的诊断价值

miR-155是一种炎症相关的miRNA，在肺癌［13］、胃癌［14］、胶质瘤［15］等多种恶性肿瘤中发挥促癌的作用。本研究结果显示，甲状腺癌组患者的血清及组织中miR-155 的相对表达量均明显高于良性对照组，且分化型甲状腺癌患者血清及组织中miR-155的相对表达量与淋巴结转移、肿瘤大小、TNM 分期有关。这与Geng 等［16］研究结果一致，提示miR-155在甲状腺癌呈高表达，且其高表达与肿瘤的恶性进展有关。丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）信号通路是促进肿瘤细胞增殖、侵袭的关键通路。吴兆书等［17］发现，过表达miR-155可通过激活MAPK/ERK 信号通路促进甲状腺癌细胞的增殖和侵袭。还有相关基础研究显示，miR-155可通过激活Wnt/β-catenin信号通路和上调人错配修复蛋白mutL同系物1（hMLH1）的表达而调控甲状腺癌的进展［18-19］。由此可推测，miR-155 在分化型甲状腺癌中发挥着促癌的作用，其可能通过调节多个信号通路以及相关蛋白影响肿瘤细胞的侵袭、迁移，进而影响淋巴结转移。

miRNA 具有稳定表达、易检测等特点，是目前研究较多的生物标志物类型，可作为传统诊断手段的有效补充［20］。临床组织样本获取需要手术或有创检查，不适宜作为术前评估病情的手段，因此本研究仅分析了血清miR-155对分化型甲状腺癌淋巴结转移的诊断价值。ROC分析发现，超声以及血清miR-155对分化型甲状腺癌淋巴结转移均有一定的诊断价值，但漏诊率和误诊率均超过10%。而两者联合应用后使得诊断价值得到了进一步的提升，漏诊率和误诊率也降至10%以下。

综上所述，分化型甲状腺癌患者血清及组织中miR-155 的表达均异常升高，且其表达水平与肿瘤的恶性进展有关。检测血清miR-155的水平可用于辅助超声诊断分化型甲状腺癌患者的淋巴结转移情况，miR-155 可作为诊断分化型甲状腺癌患者淋巴结转移的备选生物标志物。然而，本研究尚存在不足之处，如纳入病例数较少，未分析miR-155与患者预后以及复发情况的关系等，这些将在后续的研究中不断完善。