脂肪干细胞旁分泌因子干预兔激素性股骨头缺血性坏死的研究

[1.遵义医科大学第五附属(珠海)医院骨科，广东 珠海519100；2.中山大学附属第一医院骨科，广东 广州510080]

长期高剂量使用激素导致的股骨头缺血性坏死称为激素性股骨头缺血性坏死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH)，其致残率较高，是骨科常见的难治症之一。目前，SANFH主要治疗手段包括髋关节牵引制动、中药治疗、钙剂治疗等，但都缺乏确切疗效。脂肪组织遍布于哺乳动物全身，不仅维持能量代谢，而且有内分泌作用，给组织工程和再生医学领域提供了新的研究方向。其中干细胞工程将脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)用于骨关节炎、糖尿病、心脏病、乳房切除后和面部创伤后修复中的软组织再生和重建[1]，也有研究提出ADSCs可用于修复缺血坏死的股骨头，帮助其重建骨小梁等结构[2]，让SANFH患者看到了治疗的新曙光。有观点认为，ADSCs在一些组织损伤的治疗过程中主要依赖其旁分泌功能作用[3]，而目前对于ADSCs旁分泌因子的研究主要集中于心肌梗死、皮肤软组织修复及抗衰老等方面,国内外尚未见ADSCs治疗SANFH的相关报道。因此，本研究拟建立兔SANFH模型，评价ADSCs旁分泌因子治疗兔SANFH的疗效。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

实验动物：63只体质量2～3 kg的SPF级雌性家兔，由四川大学华西医院动物实验中心提供，实验动物合格证号:SCXK(川)2014-0013。主要仪器：血液流变分析仪(LG-R-80A，北京世帝科学仪器有限公司)、signal excite HD-1.5 Twin-speed MRI扫描仪(GE，美国)、显微镜(Leica DM3000，Leica，德国)。主要试剂：4%多聚甲醛固定液(生产批号：20190103，银川市伟博鑫生物科技有限公司)、甲基强的松龙琥珀酸钠(生产批号：20190723，普强苏州制药有限公司)、注射用普鲁卡因青霉素(生产批号：A1900417，华北制药集团先泰药业有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与动物造模[4]随机取42只家兔，采用马血清联合甲基强的松龙琥珀酸钠建立SANFH模型：取马血清(10 mL/kg)于兔耳缘静脉注射，3周后重复注射1次；重复注射马血清2周后在兔腹腔内注射甲基强的松龙琥珀酸钠(45 mg/kg)，每天1次，连续3 d。注射激素期间同时肌肉注射青霉素10万单位预防感染，每天1次，连续7 d。通过电子计算机X射线断层扫描机行双侧股骨头断层扫描成像，骨小梁大量空骨陷窝形成或存在核固缩骨细胞，且骨小梁周围骨髓组织发生坏死则可定义为骨坏死，提示造模成功。造模完成后将42只家兔随机分为模型组和干预组，每组21只，其中干预组在家兔的股骨头关节腔注射ADSCs旁分泌因子100 μL，制作方法：取2×106个ADSCs细胞混悬于1 mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)中，取0.1 mL PBS与0.1 mL透明质酸以1∶1的比例混合制成；模型组家兔在股骨头关节腔注射等量生理盐水。其余21只家兔设为对照组，每次均在兔耳缘静脉和腹腔内注射等量的生理盐水，同时预防性肌肉注射青霉素预防感染，每天1次，连用7 d。

1.2.2 家兔ADSCs制备[5]无菌条件下取各组家兔颈背部脂肪组织约3 g，去除血管及浅筋膜等组织后用PBS反复冲冼，剪碎至糊状，置于37 ℃恒温振荡水浴摇床中，并注入浓度为0.1%的Ⅰ型胶原酶0.2 mL。使用等体积完全培养基中和，离心，弃上清,沉淀，重悬，80目尼龙筛网过滤后接种于培养基中，37 ℃、5% CO2孵箱内培养。5 d后换液，吹去红细胞。待细胞长满培养孔面积的60%，使用0.25%胰蛋白酶消化，进行原代传代。最终将细胞制成2×106/mL的ADSCs条件培养液备用。

1.2.3 血液流变学指标检测 在治疗前及治疗4周后，于禁食12 h后在家兔耳缘静脉采血5 mL，使用血液流变分析仪测定家兔全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数和红细胞压积等血液流变学指标。

1.2.4 血清软骨生长相关因子检测 取2 mL血样，于4 ℃以1 500 r/min离心5 min，取上清，放射免疫法测定样本骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的含量。

1.2.5 MRI最大灌注参数检测 在治疗前及治疗4周后，以3%戊巴比妥钠麻醉家兔，使之仰卧于磁共振平台上，髋关节充分外展，将表面线圈固定于双侧髋关节外侧体表，对双侧髋关节进行动态增强核磁扫描。采用T1加权的超快梯度回波，在125 s内获得256张动态图像。预扫描15 s取得基线数值后，使用自动高压注射仪以0.5 mL/s的速度和0.5 mmol/kg的剂量通过耳缘静脉注射Gd-DTPA和6 mL生理盐水。选择股骨头位置作为感兴趣区测定信号强度。基线信号强度定义为前15 s获得的图像信号强度平均值，最大信号强度定义为125 s测定时间内的峰值。灌注参数最大信号增强=(最大信号强度-基线信号强度)/基线信号强度×100%，将双侧股骨头最大信号增强的平均值作为每只家兔灌注参数的评价指标。

1.2.6 HE染色观察病理形态 完成上述所有检测后，处死家兔，取双侧股骨头标本，10%多聚甲醛固定24 h，快速脱钙液脱钙16 h，常规石蜡包埋切片后行HE染色，中性树脂封片。显微镜下观察骨组织、骨髓组织、骨小梁及髓内脂肪组织的变化。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 家兔股骨头病理切片结果

对照组家兔的股骨头标本中可见骨小梁排列整齐、致密饱满，有成骨细胞附着，骨细胞清晰可见，骨细胞核位于中央，髓腔内造血细胞丰富(图1a)。模型组家兔的股骨头标本中可见骨小梁周围成骨细胞缺失，形成大量空骨陷窝，血管内血栓形成；骨细胞核固缩、坏死，骨髓腔内出血，造血细胞坏死(图1b)。干预组家兔的股骨头标本中骨细胞核固缩不明显，骨陷窝较对照组略增加部分，部分细胞核周围可见空晕形成(图1c)。

a:对照组；b：模型组；c：干预组图1 家兔股骨头切片

2.2 家兔MRI最大灌注参数比较

治疗前，3组MRI最大灌注参数比较差异有统计学意义(F=341.625，P<0.05)，且干预组和模型组均显著低于对照组(P<0.05)，干预组与模型组比较，差异无统计学意义(P=0.437)。治疗后，3组MRI最大灌注参数比较差异有统计学意义(F=89.761，P<0.05)，且对照组和干预组均显著高于模型组(P<0.05)，干预组与对照组比较差异无统计学意义(P=0.331)。治疗后，对照组MRI最大灌注参数与治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)；干预组和模型组MRI最大灌注参数均较治疗前显著升高(P<0.05)，见图2。

*：与本组治疗前比较，P<0.05图2 家兔最大灌注参数比较

2.3 治疗后家兔血液流变学指标比较

治疗前，干预组和模型组各血液流变学指标均高于对照组(P<0.05)；但干预组与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与治疗前比较，治疗后干预组各血液流变学指标均显著下降(P<0.05)，对照组和模型组与治疗前比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后，3组各血液流变学指标比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，且模型组均高于对照组和干预组(P<0.05)，干预组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 家兔血液流变学指标比较

2.4 家兔血清BMP-2和TGF-β水平

治疗前，对照组BMP-2和TGF-β含量高于模型组和干预组(P<0.05)，模型组和干预组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与治疗前比较，治疗后干预组BMP-2和TGF-β水平均显著升高(P<0.05)，模型组和对照组BMP-2和TGF-β水平无明显变化(P>0.05)。治疗后，模型组BMP-2和TGF-β水平低于干预组与对照组(P<0.05)，但干预组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 家兔血清BMP-2和TGF-β水平

3 讨论

一项研究表明，高剂量皮质类固醇(强的松类>20 mg·kg-1·d-1)的使用与股骨头坏死之间存在显著相关性[6]，而其长期使用是导致非创伤性股骨头坏死的主要原因[7]，这可能是由于长期使用高剂量糖皮质激素可直接或间接导致凝血障碍，使血液处于高凝状态，显著降低股骨头和股骨颈血流量[8]，随后出现血流不畅、缺血，最终导致缺血性股骨头坏死。研究表明，ADSCs可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱等多种细胞，补充替代老化、缺损的组织细胞；还可通过旁分泌功能合成及分泌多种细胞因子、多肽类、气体分子等活性成分，提高受损细胞的生命力和抗凋亡能力。但也有研究认为，ADSCs在一些组织损伤的治疗过程中主要依赖旁分泌功能，因而ADSCs的旁分泌功能成为了目前研究的热点[9]。本研究通过建立兔SANFH模型，探讨ADSCs旁分泌因子治疗兔SANFH的疗效。

通过MRI观察家兔股骨头组织内部血流的灌注情况，可以评估组织血液灌注状态[10]。Kolb等[11]和Momii等[12]使用MRI评估坏死股骨头的血运重建，认为通过MRI可了解股骨头血流灌注情况，评估股骨头状态。本研究运用MRI评估家兔股骨头血液灌注情况，结果显示，干预组和模型组治疗后MRI最大灌注参数均显著上升，且干预组治疗后MRI最大灌注参数显著高于模型组，而治疗后干预组和对照组最大灌注参数差异无统计学意义。表明ADSCs可改善SANFH家兔股骨头的血液灌注情况，且经ADSCs旁分泌因子干预的家兔恢复情况显著优于模型组，可达到对照组水平，即与正常家兔无异。微循环中血液黏度主要受红细胞可变性和血浆黏度的影响[13]，红细胞可变性下降可使微循环阻力增加、血液流动减慢，从而增加血液黏度。血液黏度的增加在血循环中表现为血流速度减慢、红细胞相互聚集，进而导致股骨头血液灌注量降低，使骨细胞处于缺血、缺氧状态，股骨头血供明显减少，最终导致股骨头缺血性坏死。Drescher等[14]的研究表明，高剂量甲基强的松龙输注会导致猪的股骨头血液流变学改变，血流量减少，血浆高凝，最终导致股骨头坏死的发生。Chen等[15]的研究表明，促红细胞生成素可通过抑制成骨细胞和骨细胞的凋亡及增加血管内皮生长因子的表达，对糖皮质激素引起的股骨头坏死起到显著的保护作用。Worrall等[16]的研究则认为血红蛋白红细胞压积比率对儿童股骨头坏死有较好的预测性。本研究结果显示，治疗后对照组和干预组高切、中切和低切全血黏度均显著低于模型组，且血浆黏度、红细胞聚集指数和红细胞压积也显著低于模型组，这表明经ADSCs旁分泌因子干预的家兔股骨头血液流动性显著优于模型组。BMP-2可以补充分化成骨祖细胞的间充质细胞，刺激骨祖细胞分化为骨系细胞[17]。TGF-β是一类细胞生长分化调节蛋白，能够促进骨膜中成骨细胞和成软骨细胞增生，促使骨细胞胶原及基质蛋白的合成和钙化，减少破骨细胞的形成，抑制骨吸收[18]。本研究发现，治疗后干预组BMP-2和TGF-β显著升高，且干预组显著高于模型组，这表明干预组股骨头坏死部位得到了修复，经ADSCs旁分泌因子干预可以促进股骨头的修复。

综上，ADSCs旁分泌因子可以有效改善SANFH家兔组织的血液灌注和血液流变学参数，对SANFH有积极的治疗效果。但本研究为小样本单中心动物研究，研究时间较短，尚需大样本量、远期动物模型以及临床研究进一步证实。