杏花一测多评方法的建立及不同储存环境各成分的含量比较

闫伟伟,徐 鹏,罗慧玉,丁 杰,贺丽霞,陈正源

0 引言

杏花为蔷薇科植物杏或山杏的干燥花,味苦,性温,无毒[1],杏花有一定的药用历史,中医典籍中记载其可用于活血补虚,去除面部粉滓[2-3]。杏在我国分布广泛,所含化学成分丰富,现代研究表明，其主要含有多糖、多酚、总黄酮类、挥发性成分及其他成分等[4-7],民间常以其作为茶饮使用[8-9],也有报道其被开发成杏花露使用[10-11]。一测多评法是基于一个对照品为内参物,实现多成分同时测定[12]的质控方法,该方法快速、简便,成本低,近年来被广泛应用[13-15]。前期课题组已通过单因素试验成功建立了杏花中芦丁、阿魏酸、异槲皮苷含量的测定方法[16],为节省资源,缩短分析时间,本试验采用QAMS 法，以芦丁为内参物,对杏花中3种成分进行含量测定,对其原有测定方法进行优化和改进,并对不同储藏环境下的杏花各成分含量进行测定比较。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 芦丁(批号:100080-201408,纯度90.2%)、阿魏酸(批号:110773-201012,纯度99.6%)、异槲皮苷(批号:111809-201403,纯度92.9%)来源于中国食品药品检定研究院;乙腈、磷酸为色谱纯,乙醇为分析纯。

1.2 药材 杏花药材样品 10 批,由河北省药品检验研究院段吉平主任药师鉴定:7 批为蔷薇科植物杏的干燥花,3 批为蔷薇科植物山杏的干燥花,见表1。

表1 药材样品信息

1.3 仪器与设备 高效液相色谱仪(岛津LC-2010A HT型):岛津公司;分析天平(CPA225D):德国赛多利斯集团,纯水/超纯水机(Milli-Q Integral):美国Millipore 公司;YMC C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm):YMC公司。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸对照品14.60 mg,芦丁对照品 30.40 mg,异槲皮苷对照品17.80 mg,分别置于100、10、100 ml 量瓶中,加70%乙醇溶液定容至刻度,分别制成浓度为0.145 4 mg/ml、2.742 1 mg/ml、0.165 3 mg/ml的对照品储备液。精密量取各储备液5 ml,置同一50 ml量瓶中,加70%乙醇溶液稀释至刻度,摇匀,制成浓度为阿魏酸14.541 6 μg/ml、芦丁274.21 μg/ml、异槲皮苷16.536 2 μg/ml的对照品溶液。

图1 混合对照品(A)和供试品溶液(B)的HPLC图

2.1.2 供试品溶液的制备 取杏花粉末(过四号筛)约1.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇20 ml,密塞,称定重量,超声处理30 min,放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,用0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.2 色谱条件 色谱柱:YMC C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸(15∶85);流速:1.0 ml/min;检测波长:343 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μl。

2.3 正交试验 经过单因素预试验,采用L9(34)正交试验以异槲皮苷、芦丁和阿魏酸的含量为评价指标,以乙醇浓度(A)、溶剂体积(B)、提取时间(C)为考察因素,分别选择3个水平(A:60%、70%、80%;B:10 ml、20 ml、30 ml;C:20 min、30 min、40 min)进行正交试验,结果见表2～表4。由表3可知,各因素对异槲皮苷的影响大小是A>C>B,最佳提取条件为A2B2C2;各因素对芦丁的影响大小是A>C>B,最佳提取条件为A2B2C2;各因素对阿魏酸的影响大小为A>C>B,最佳提取条件为A2B2C3。由表4可知,乙醇浓度(A)对3个成分结果的影响存在显著性差异,溶剂体积(B)与提取时间(C)对芦丁和异槲皮苷的结果无显著影响。综合各项指标,确定最佳提取条件为A2B2C2,即70%乙醇,20 ml,超声30 min。精密称取同一产地杏花3份,每份1.0 g,对最佳提取条件进行验证,3次试验结果异槲皮苷平均含量为0.324 1 mg/g,芦丁平均含量为6.933 0 mg/g,阿魏酸平均含量为0.327 2 mg/g,优于正交试验各组数据,表明所确定的最佳提取条件稳定可行。

表2 L9(34)正交试验设计及结果

表3 直观分析

表4 方差分析结果

2.4 相对校正因子的建立 采用多点校正法。精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液 2、5、10、15、20 μl注入液相色谱仪中,记录峰面积,以芦丁为内参物,分别计算阿魏酸、异槲皮苷的相对校正因子(表5),取其平均值作为定量fs/i,确定阿魏酸的相对校正因子f芦/阿为0.486 3,异槲皮苷的相对校正因子f芦/异为0.751 9。

表5 各成分的相对校正因子(fs/i)和相对保留时间(ts/i)

2.5 相对校正因子的耐用性考察

2.5.1 仪器与色谱柱的考察 分别考察热电BOS HYPERSIL(250 mm×4.6 mm,5 μm)、YMC-Pack(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Waters SunFire(250 mm×4.6 mm,5 μm)3种C18色谱柱与岛津LC-2010A HT、Waters e 2695-2998、岛津LC20 AT 3个品牌高效液相色谱仪对校正因子的影响,结果(表6)各成分均能实现良好分离,各成分校正因子的RSD均小于5.0%,表明高效液相色谱仪和色谱柱对各成分校正因子无显著影响。

表6 不同色谱柱与高效液相色谱仪对相对校正因子(fs/i)和相对保留时间(ts/i)的影响

2.5.2 柱温、流速的考察 采用岛津LC-2010A HT高效液相色谱仪和YMC-Pack C18色谱柱,考察不同柱温(28、30、32 ℃)、流速(0.9、1.0、1.1 ml/min)对校正因子的影响,结果(表7)各成分校正因子的RSD均小于5.0%,表明柱温和流速对各成分校正因子无显著影响。

2.6 待测成分色谱峰的定位 以芦丁保留时间的相对值结合紫外吸收光谱特征作为待测成分的定位标准。按“2.4”项下测得保留时间计算阿魏酸和异槲皮苷的保留时间的比值ts/i(ts/i=t芦丁/待测成分)(结果见表5),阿魏酸的t芦/阿为1.072 5,异槲皮苷的t芦/异为0.838 3。按“2.5”项下对ts/i进行耐用性考察,结果(表 7)表明,在不同的色谱仪、色谱柱、柱温和流速下,测得各待测成分的相对保留时间ts/iRSD均小于5.0%,可用来对待测成分色谱峰进行确认。

表7 不同柱温与流速对相对校正因子(fs/i)和相对保留时间(ts/i)的影响

2.7 样品含量测定及比较 取10批次不同来源的杏花按照供试品溶液制备方法进行样品处理,采用ESM和QAMS法计算3个成分含量结果见表8,并采用t检验比较,2种方法测得结果无显著性差异,表明所建立的QAMS法可用于杏花药材的含量测定。

表8 QAMS法与ESM法含量测定结果比较

2.8 不同储存环境中含量测定与比较 取S5号杏花3份,每份100 g,第1份自封袋封口置于干燥器中放于温度为4 ℃的冰箱环境中(低温低湿环境),第2份自封袋封口置于储藏室温度25 ℃,湿度45%～75%环境中(常温常湿环境),第3份自封袋敞口置于温度为35 ℃,湿度为85%以上的密封环境(高温高湿环境)。对杏花药材各成分含量进行为期12个月的考察,分别于1个月、4个月、8个月、12个月测定其各成分含量,同时,应用SPSS统计分析软件对在3种储藏环境下3种成分含量进行单因素方差分析,分别以各成分的含量为因变量,3种储藏环境为自变量。结果(表9)表明,芦丁和异槲皮苷含量随着储藏时间的增长有所降低,常温常湿与低温低湿2种环境对两成分含量的影响无显著差异;高温高湿环境下,2种成分含量下降明显,存在显著差异。阿魏酸含量随着储藏时间的增长略有升高,常温常湿环境下,阿魏酸含量较其他2种环境升高明显,存在显著差异,高温高湿与低温低湿2种环境对阿魏酸含量的影响无显著差异。

表9 不同储藏环境下杏花化学成分含量

3 讨论

课题组前期对供试品溶液的制备进行了选择优化,对色谱条件、方法学考察与提取方法单因素试验进行了试验研究并已发表[16]。芦丁、阿魏酸与异槲皮苷标准曲线的相关系数均为0.999 9,三成分色谱峰与其他色谱峰均能实现良好分离,精密度、重复性、稳定性与加样回收率均能达到要求。基于单因素试验的结果,本试验进行了以乙醇浓度、溶剂体积、提取时间为考察因素的正交试验,最终确定以70%乙醇20 ml提取30 min作为供试品溶液提取方法。

依据QAMS法建立技术指南,内参物优选含量较高、保留时间适中的有效成分。本试验中,芦丁较阿魏酸和异槲皮苷含量高,且相对价廉易得,综合考虑,确定芦丁为内参物。在待测成分色谱峰的定位中,采用待测成分与内参物的相对保留时间进行定位,并结合色谱峰峰型及紫外吸收光谱特征,可准确判断出目标峰的位置进行准确定位。

采用QAMS法对不同储存环境下的杏花各成分含量进行测定。研究发现,常温常湿与低温低湿对杏花中芦丁与异槲皮苷无显著影响,均呈略有下降趋势,而高温高湿状态下降明显。阿魏酸则在常温常湿环境下含量有所升高,且较另2种环境升高明显,可能与微生物活动导致“陈化”现象有关;在低温低湿环境下“陈化”现象不明显;而高温高湿环境下可能在发生“陈化”现象的同时,杏花中复杂的成分间发生了相互作用,导致含量变化不大，有待进一步研究。故从杏花总体质量综合考虑,建议杏花选择常温常湿储存。

本试验首次采用正交试验结合QAMS 法对杏花进行质量控制,测定杏花中芦丁、阿魏酸、异槲皮苷的含量,与外标法测得值没有显著性差异。表明所建立的方法有效可行,能实现对杏花中多种有效成分的质量控制。