HPLC法测定维格列汀原料中R型异构体的含量

段立军

（青岛黄海制药有限责任公司，山东 青岛 266000）

维格列汀（Vildagliptin）是一种可口服给药的二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂，具有选择性、竞争性和可逆性，主要通过抑制DPP-Ⅳ的蛋白水解酶活性，增强胰高血糖素样肽（GLP-1）和肠抑胃肽（GLP）的活性，发挥降血糖作用[1]。维格列汀能够改善2型糖尿病病人的胰岛素抵抗，显著降低病人的炎症因子水平，并通过调控结缔组织生长因子（CTGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达而发挥肾脏保护作用[2-3]。维格列汀单独用药可改善血糖控制，并发症少，耐受性好；与二甲双胍、磺脲类、噻唑烷二酮类药物联合应用可增强疗效，且不增加低血糖的风险，也不增加体重[4-5]。

维格列汀结构中有1个手性碳原子，理论上具有2个手性异构体，即R构型和S构型。维格列汀以共价键结合的方式来抑制DPP-Ⅳ酶的活性部位发挥作用，R构型的异构体因具有较大的空间位阻[6]，在一定程度上会影响维格列汀对DPP-Ⅳ酶活性的抑制效果，因此为了发挥出更好的体内活性，应在维格列汀或中间体中控制R型异构体的含量。据报道，正相手性色谱柱对化合物的对映异构体具有良好的分离效果，广泛应用于化合物对映异构体含量的测定中[7-8]。本文建立了采用正相高效液相色谱法、用手性色谱柱对维格列汀中的R型异构体进行含量测定的色谱方法。

1 实验部分

1.1 实验仪器

Thermo U3000 高效液相色谱仪、CHIRALPAK IE 手性色谱柱、XS205DU型电子天平。

1.2 药品与试剂

R-维格列汀对照品（含量99.4%）、维格列汀（含量99.8%）、正己烷（色谱级）、乙醇（色谱级）、甲醇（色谱级）、二乙胺（色谱级）、三氟乙酸（色谱级）。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱为CHIRALPAK IE手性色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为正己烷-乙醇-甲醇-二乙胺-三氟乙酸（72∶24∶4∶0.05∶0.05），柱温为35℃，流速为0.8mL·min-1，检测波长为215nm，进样量为10μL。

2.2 溶液的制备

R型异构体对照品溶液：精密称取维格列汀R型异构体对照品适量，加无水乙醇溶解后，配制成维格列汀R型异构体浓度为6μg·mL-1的溶液。

系统适用性溶液：各取适量维格列汀对照品和R型异构体对照品，加无水乙醇溶解并定量稀释后，配制成浓度分别为3mg·mL-1和6μg·mL-1的混合溶液。

供试品溶液：精密称取供试品30mg，加无水乙醇溶解并定量稀释，配制成维格列汀浓度为3mg·mL-1的溶液。

空白溶液：取无水乙醇作为空白溶剂。

2.3 系统适用性实验

精密量取2.2中的空白溶液、系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液各10μL，进样分析，色谱图见图1。维格列汀R型异构体与维格列汀的分离度为5.43，大于1.5，表明系统适用性实验符合要求。

图1 HPLC 色谱图a.blank solvents; b.system suitability solution; c.standard solution; d.test sample; 1.R-vildagliptin; 2.vildagliptinFig 1 HPLC chromatograms

2.4 检测限与定量限

精密称取维格列汀R型异构体适量，加无水乙醇稀释后，精密量取10μL进样进行测定。维格列汀R型异构体的检测限为0.62μg·mL-1，相当于供试液浓度的0.01%；定量限为1.53μg·mL-1，相当于供试液浓度的0.04%。

2.5 线性关系实验

精密称取维格列汀R型异构体适量，用无水乙醇溶解并稀释成浓度分别为 1.5、5.0、8.0、10、12、15μg·mL-1的溶液。精密量取上述溶液各10μL，依次注入液相色谱仪并记录色谱图。以峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标，进行线性回归，回归方程为：Y=11.22X-2.44（r=0.9999），说明维格列汀R型异构体在2.0~15μg·mL-1浓度范围内线性良好。

2.6 回收率实验

取维格列汀原料适量，加无水乙醇溶解后，分别加入维格列汀R型异构体贮备液适量，定量稀释后，配制成维格列汀浓度为3mg·mL-1、以及相当于 R 型异构体浓度分别为 1.5（定量限）、5.0、10、15μg·mL-1的溶液。每个浓度水平取3份，分别注入液相色谱仪，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率实验结果（n=12）Table 1 Results of recovery tests（n=12）

2.7 精密度实验

取同一批号的供试品，在不同日期，分别由2名分析人员在2台高效液相色谱仪上，按对映异构体的分析方法，各平行测定6份样品。测得的R型异构体含量均在检测限以下，视为未检出，表明该方法的精密度良好。

2.8 样品含量测定

选取3批自制的中试样品（2005701、2005702、2005703）和原研制剂（商品名佳维乐Galvus）分别制备成样品溶液。精密量取样品溶液10µL，注入液相色谱仪进行测定。R型异构体的含量均低于检测限，即未检出。

3 讨论

本研究采用高效液相色谱法，以直链淀粉-三（3,5-二氯苯基氨基甲酸酯）键合硅胶为填充剂，正己烷-乙醇-甲醇-二乙胺-三氟乙酸（72∶24∶4∶0.05∶0.05）为流动相，对维格列汀中的R型异构体进行含量测定。结果表明，本方法的专属性强，灵敏度高，线性、准确度和精密度良好，可有效测定维格列汀R型异构体，为企业对维格列汀产品的质量控制提供了实验依据。