用于粪便DNA检测的样本保存液制作和效果评估

李 博，李改瑞，赵 伟，彭晓琳，*，赵 丹，彭 绩

(1．深圳市南山区慢性病防治院肿瘤伤害与营养科，广东 深圳518054；2．海南省疾病预防控制中心，海南 海口570203；3．深圳市慢性病防治中心肿瘤防治科，广东 深圳518020)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，虽然近年来其筛查手段已有了很大的进步，但是我国结直肠癌的发病率依然居高不下。结直肠癌具有患病率高、癌前病变(如息肉、腺瘤)界定明确，且发展到癌变需要较长(10～15年)时间等特点，这为在出现临床症状之前的早期干预提供了极好的机会。目前结直肠镜取材标本的病理学检查还是诊断结直肠癌的金标准，由于其成本高、并发症发生率高和手术的侵入性，使受试者的依从性普遍较低。粪便隐血试验因其成本较低，检测方便、快捷，目前较广泛地应用于结直肠癌的早筛早诊，然而，其明显不足的是对癌前病变(如息肉和腺瘤)及早期结直肠癌的筛查灵敏度较低。针对粪便样本开发结直肠癌早期筛查分子标志物是目前结直肠癌无创早筛研究领域的一个热点。但目前这种检测整体存在价格较高的问题，仅适用于特殊人群，筛查成本效益比偏低，其中样本前期采集、处理、保存需要大量的运输成本及人力成本。基于此，本研究配制了一种适用于结直肠癌大样本人群筛查可以常温运输保存的粪便样本保存液，并对其保存粪便样本中人源DNA完整性及抑制微生物增殖的效果进行了评估。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

StepOne Plus荧光实时定量PCR仪、NanoDrop One超微量分光光度计、Qubit 4荧光计和粪便样本保存 液RNAlaterSolution，均 购 于Thermo Fisher Scientific公司，粪便样本基因组DNA提取试剂盒购于深圳市南科征途有限公司，dsDNA HS(高灵敏度)检测试剂盒购于Invitrogen公司。

1.2 自制粪便保存液的组分及制作

自制粪便样本保存液主要包括：细胞缓冲组分、离子螯合DNA稳定组分和微生物防增殖组分等。其中细胞缓冲组分为三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris]、氯化钠(sodium chloride)，离子螯合DNA稳定组分为乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，微生物防增殖组分为硫酸铵(ammonium sulfate)及水组成。

首先制备三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液；其次制备乙二胺四乙酸溶液；再次制备氯化钠溶液；最后将硫酸铵溶于水中加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液、乙二胺四乙酸溶液、氯化钠溶液混合后，用盐酸调节pH值得到成品(各组分浓度等相关技术细节正处于专利申请中，故不作详细描述)。

1.3 粪便样本的采集与处理

1.3.1 粪便样本的保存和分组

1个健康受试者的新鲜粪便样本均分为4份。实验组采用自制保存液与人粪便样本1∶1体积混匀，1份室温放置3 d，1份室温放置7 d。对照组采集粪便样本直接置于空管中，1份室温放置1 h内，1份室温放置3 d。

1.3.2 不同冻融条件下自制粪便样本保存液效果比较

3个健康志愿者(A/B/C)的新鲜便样，用自制保存液与人粪便样本1∶1体积混匀后，分别均分为5份，进行如下处理：①室温保存1 d、-80℃冻存6 d；②室温保存2 d、-80℃冻存5 d；③室温保存3 d、-80℃冻存5 d；④-80℃冻存7 d；⑤为对照组，室温保存7 d。

1.3.3 自制保存液与RNAlater的效果比较

1个健康志愿者的新鲜便样均分成6份，1份采集粪便样本直接置于便样采集空管，1份粪便样本与RNAlater按1∶1体积混匀，其余4份粪便样本与自制保存液1∶1体积混匀。置于保存液中的5份样本均室温放置7 d。

1.3.4 自制保存液用于保存结直肠癌早筛人群粪便样本

队列一：收集社区结直肠癌早筛人群新鲜粪便样本434份，2～8℃冷链运输并分装，当天置于-80℃低温冰箱保存。队列二：采用自制保存液收集社区结直肠癌早筛人群新鲜粪便样本501例，常温运输，3 d内转入-80℃冰箱保存。

1.4 粪便样本核酸保存质量检测

1.4.1 粪便DNA提取

按照粪便样本基因组DNA提取试剂盒说明书中的操作步骤，抽提粪便中肠道细胞的DNA样本，体积约50 mL。

1.4.2 粪便DNA定性检测

采用琼脂糖凝胶电泳法，上样量5 mL。

1.4.3 粪便DNA浓度检测

使用Qubit/Nanodrop分光光度计，检测提取出的DNA浓度及纯度。

1.4.4 人源

β-globin

基因DNA拷贝数检测

针对1.3.1所述不同处理条件下保存的粪便DNA，采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法，对人源

β-globin

基因DNA拷贝数进行检测，并根据Δ

C

值(Δ

C

=

C

-

C

)，推测粪便DNA的变化情况。

1.4.5 人源

ACTB

基因DNA拷贝数检测

针对粪便样本提取的DNA，采用qPCR方法，对人源

ACTB

基因拷贝数进行检测，并根据

C

值，推测粪便DNA的总量，以

C

＜40为标准判为合格样本。

2 结果

2.1 自制保存液粪便样本DNA质量保存效果测试

同等粪便样本，在无自制保存液室温放置3 d后，DNA发生明显降解，条带变模糊，Qubit浓度明显增加，qPCR结果显示

C

值较对照组增加2.5个循环。同等粪便样本在自制保存液室温放置7 d后，条带与室温放置3 d及新鲜便样相比，条带相似，且qPCR结果显示Δ

C

≤0.2。琼脂糖凝胶电泳结果见图1，DNA浓度及

C

值变化情况见表1。

图1 4等份新鲜粪便样本在有无保存液及置室温不同时间条件下琼脂糖凝胶电泳分析

表1 4等份新鲜粪便样本在有无保存液及置室温不同时间条件下人源DNA的浓度及C t值变化情况

2.2 不同冻融条件对自制保存液保存粪便样本DNA效果比较

不同冻融条件对自制保存液保存的粪便样本DNA完整性良好，各组条带无明显异常，浓度无明显差异，qPCR结果显示Δ

C

值变化小于1。A、B、C 3个样本经不同冻融条件琼脂糖凝胶电泳结果见图2，DNA浓度及

C

值变化情况见表2。

图2 3组5等份便样不同处理条件下琼脂糖凝胶电泳分析

表2 3组5等份粪便样本在不同处理条件下人源DNA浓度及Ct值变化情况

2.3 自制保存液与RNAlater对粪便样本DNA保存效果比较

自制保存液保存粪便样本7 d后DNA条带清晰单一，优于RNAlater；qPCR结果显示自制保存液相较于新鲜粪便样本对照Δ

C

值均为负值，RNAlater保存液组Δ

C

达到了1.1。两种不同保存液对粪便样本DNA保存完整性琼脂糖凝胶电泳分析结果见图3，DNA浓度及

C

值变化情况见表3。

表3 自制保存液与RNAlater对粪便样本人源DNA浓度及Ct值变化情况比较

图3 自制保存液与RNAlater处理后的粪便样本DNA琼脂糖凝胶电泳分析

2.4 自制保存液用于结直肠癌早筛人群粪便样本DNA保存的效果比较

将自制粪便样本保存液应用于实际结直肠癌早筛人群，与未使用保存液进行保存的样本比较，qPCR检测结果显示，从结直肠癌筛查人群中收集的新鲜粪便样本的合格率为39%，而采用自制样本保存液的样本合格率可达71%。

3 讨论

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，GLOBOCAN 2020估计全球结直肠癌新发病例和死亡病例分别为193.16万和93.52万，分别位于所有恶性肿瘤的第3位和第2位。我国最新肿瘤登记年报数据显示，2015年我国结直肠癌新发病例38.8万，死亡病例18.7万，其发病和死亡数目分别位列我国恶性肿瘤的第3位和第5位。结直肠癌筛查是目前公认的减少结直肠癌发病的有效手段，美国近20年来结直肠癌发病率的下降主要得益于筛查工作的广泛开展，从1976年到2014年，美国结直肠癌的病死率从28.6/10万下降到14.1/10万。我国部分地区虽已启动大规模人群筛查，但结直肠癌发病率及病死率还在持续上升，结直肠癌防控工作任重道远，市场规模较大。

结直肠癌各筛查指南普遍将FIT、结肠镜检查作为一线筛查手段，而FIT-fecal DNA等分子学检测作为二线或三线筛查手段，主要原因还在于价格过高，成本效益比较低，不易推广等问题。近年来，“精准医疗”为疾病的检测、诊断及治疗等提供了各种新的方案，研究人员也在各自领域寻找各人群专属基因谱，粪便DNA检测作为最适合大肠癌早期筛查的检测方法之一，具有无创、较高灵敏度和特异度等优点，以此作为检测手段的产品也层出不穷，但如应用于大规模筛查人群，样本的可及性及筛查成本也必须进行控制。粪便样本中不仅含有微生物菌群生物学信息，也有来自人的肠道脱落细胞，癌症患者肿瘤上皮细胞更新速度更快，粪便中人源DNA信息会更多，而粪便样本中的核酸酶、多糖、胆酸、胆盐等成分均会对粪便DNA的保存及后续检测造成影响。

在医院或体检中心要求进行检验的粪便样本，时常因其本身收集质量或温度或环境杂质等诱发的不稳定而必须立即送检，给病人造成了不便且对医护人员送检时间要求较高，也给检测实验室增加了运作和及时提供结果的难度。而对于社区筛查人群，粪便样本保存时间及保存条件必须足够便捷，成本必须足够低，才能保证收集样本质量不受影响，促使更多的人选择该种筛查手段。因此，亟需研发一种低成本且能够有效保持粪便样本中人源脱落细胞基因信息的粪便保存试剂，且试剂组分必须不影响下游如PCR、测序等分子生物检测。

而目前公开的粪便样本保存液方法，存在两种局限性：①为抑制粪便中微生物滋生，使用不易保存易于分解的抗生素，对粪便保存条件的要求则更为苛刻；同时抗生素试剂成本较高，连带提升了产品市场价位；②使用如乙醇或氯丁醇等物质来固化菌群结构，但对人类基因组保存较难保证，同时醇类作为可燃物还会产生运输风险。因此，为解决成本较低可适用于筛查、常温保存及运输、有效保护粪便中的人源脱落细胞继而稳定细胞中的DNA不被降解、保存液各组分不会影响后续粪便样本检测几个问题，我们配制了一种经过改良的粪便样本保存液，在该保存液中，细胞缓冲组分可以保持粪便样本的pH值在7～10，可以有效防止脱落细胞破裂，并阻遏基因组DNA的降解；金属离子整合剂则用于整合粪便样本中的金属离子，从而稳定样本中DNA组分，并可抑制各种核酸酶活性；而防腐剂的添加，使粪便样本中的微生物不致过度增殖，可防止脱落细胞被微生物破坏。

该研究分别测试了自制保存液对于粪便样本常温保存3、7 d的保存能力，认为新鲜便样及在有保存液置室温3或7 d后人源DNA降解较少，

C

值各组基本稳定；而无保存液室温保存7 d后DNA降解较严重，且DNA浓度明显增加，提示可能主要由污染菌扩增导致，也提示自制保存液的主要作用一方面是保存基因信息完整性，保证人源脱落细胞的DNA不会发生明显降解；另一方面在于抑菌，使微生物源DNA也无显著增殖。测试了7 d内不同冻融条件下自制保存液的保存粪便DNA的效能，认为在有保存液的情况下，反复冻融一次对粪便基因信息的完整性及总量无明显影响。因此后期开展人群大样本量粪便样本收集时，认为经自制粪便保存液处理后，可在-80℃低温条件下长期保存，但应避免反复冻融，可冻融次数有待进一步研究。另外研究还显示自制保存液与RNAlater相比，其保存粪便基因信息及抑制微生物生长的性能要优于RNAlater，但成本却是只有其1/5。本研究通过对935例社区筛查人群粪便样本的实际应用，对比无保存液处理的新鲜便样本434例和用自制保存液处理的新鲜样本501例，并提取粪便样本DNA，经qPCR法检测人源

ACTB

基因拷贝数后发现，运用自制保存液保存人群样本的合格率(71%)高于无保存液保存的新鲜样本合格率(39%)。经对保存液保存的不合格样本进行追踪调查，影响因素主要有两种：①筛查对象在采集样本前将采集管中保存液倾掉；②样本采集部位异常引起采集样本多为食物残渣而少基因信息。由于筛查大样本时，人数众多，人员素质参差不齐，对样本采集要求的理解程度等的不同，对采集质量造成一定的影响。后续应用过程中需对采样说明进一步明确，同时加强医务人员的培训以便更好地指导居民采样。

综上所述，本研究通过改良市场粪便样本保存液的配方，模拟社区人群结直肠癌筛查过程中样本收集时间及温度，对其保存性能进行一系列的测试，开发了一种可以应用于结直肠癌筛查人群粪便样本保存的保存液，并通过较大人群验证，为后续经济、有效、便捷地进行分子生物学检测前的大样本人群粪便样本采集提供参考和依据。