核受体FXR激活对宫颈癌CaSki细胞增殖的抑制效应及其作用机制

黄晓华，牛永东，石刚刚，*

(1．汕头大学医学院第二附属医院，广东汕头515041；2．汕头大学医学院，广东汕头515041)

宫颈癌是世界范围内第三大常见的恶性肿瘤，在女性病死率中排名第四。近年来，我国宫颈癌的病死率呈上升趋势，2003—2013年发病率也稳步上升。研究表明，HPV可以通过抑制p53和Rb等关键蛋白来促进宫颈癌的发生和发展。

核受体是配体激活的转录因子，含有48个成员。法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)是核受体超家族中的成员，它最初是由Seol与Forman等在1995年发现的。FXR可以被胆汁酸激活，FXR激动剂如GW4064、CA、LCA、CDCA也可激活FXR表达。FXR在肝、肾、肾上腺等组织中高表达，在宫颈组织、脂肪组织和心脏组织中也有表达。FXR与视黄醇X受体(retinoid X receptor，RXR)形成异源二聚体，结合到靶基因的启动子如小异源二聚体伴侣(short heterodimer partner，SHP)上。除了肝脏再生和炎症的作用之外，FXR还调节肝细胞癌、胰腺癌和胃癌的发生和增殖。FXR在未交配兔和孕兔所有类型的卵泡、卵巢间质均有表达。FXR的表达与雌激素受体表达呈线性关系。在雌激素阳性的肿瘤当中，FXR与增殖标记Ki-67表达密切相关。宫颈癌的发生发展与雌激素密切相关，目前FXR在女性生殖组织中的作用仍不清楚，尤其是对宫颈癌的发生有无影响尚未见报道。本文采用FXR激动剂GW4064作用宫颈癌CaSki细胞，观察FXR激活对宫颈癌细胞增殖的影响，并探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

宫颈癌细胞株CaSki购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。本研究使用的主要试剂有：DMEM培养基(Life)；胎牛血清(Biowest)；Trizol试剂盒、Primer Script逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂(TaKaRa)；四甲基噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)、FXR激 动剂GW4064(Sigma)；兔抗人FXR、鼠抗人p53(Santa)；鼠抗人β-actin(Zsbio)；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗小鼠IgG(Boster)；Annexin V，FITC凋亡检测试剂盒(东仁)。

本研究使用的主要仪器有：二氧化碳恒温细胞培养箱(Panasonic)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；倒置相差显微镜(Nikon)；多功能酶标仪(Spectra Max)；BD accuritm C6流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组

CaSki细胞培养在含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL的DMEM培养基，于37℃、饱和湿度、CO体积分数为5%的培养箱中，每隔两天更换一次培养基。GW4064是公认的FXR激动剂，实验设DMSO(1 μL/mL)对照组及GW4064作用组。每组实验重复3次。

1.2.2

RNA提取和实时荧光定量PCR

细胞贴壁后加入10 μmol/L的GW4064作用24 h，用Trizol试剂盒提取RNA。按照逆转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA。实时荧光定量PCR检测FXR mRNA水平。βactin作为内参。实验重复3次。采用2法计算FXR的表达量。按照表1配制PCR反应混合液。将混合液混匀后离心，置于ABI 7500荧光定量PCR仪中进行反应。95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、34 s，40个循环。引物序列如表2所示。

表1 PCR反应混合液的配制

表2 PCR引物序列

1.2.3 Western blot

采 用Western blot检 测FXR及p53的蛋白水平。细胞贴壁后加入10 μmol/L的GW4064作用48 h，PBS洗涤后加入RIPA裂解液，放置在冰上裂解30 min，期间每隔5 min振荡1次。取裂解液4℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清液采用煮沸法变性后置-20℃保存。用10%的SDSPAGE电泳分离蛋白，采用湿转恒压100 V、75 min转移到硝酸纤维素(NC)膜上，将NC膜放入封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)中，室温下封闭60 min，然后滴加一抗4℃孵育过夜。次日TBST洗涤后，滴加二抗室温孵育1 h后曝光。蛋白条带用灰度值量化表示。β-actin作为阳性对照。

1.2.4

MTT法检测细胞存活率

将CaSki细胞分别置于96孔板中，每孔3 000个细胞。当细胞贴壁后，加入DMSO或GW4064至培养基中继续培养24、48和72 h。弃去培养基后每孔加入不含血清的DMEM(内含10 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液)，37℃孵育4 h，弃去培养基后每孔加入150 μL DMSO并振荡10 min。用多功能酶标仪在490 nm处读取吸光度值

D

(490)。

1.2.5 细胞凋亡率检测

将细胞接种于60 mm平皿中，加入DMSO或GW4064至培养基中继续培养24、48、72和96 h。采用胰酶消化法将细胞收集到EP管中，制成1×10个/mL的细胞悬液；PBS洗涤后，将100 μL预先配好的1×Annexin V结合液加入细胞沉淀中，加入5 μL Annexin V、FITC以及5 μL PI溶液，避光在室温中孵育15 min，加入1×Annexin V结合液400 μL；流式细胞仪检测细胞凋亡率，发光波长(Ex)为488 nm，激发波长(Em)为530 nm。

1.3 统计分析

实验重复3次，数据用

x

ˉ±

s

表示，计量资料的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，应用SPSS 22.0统计软件进行分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 GW4064作用CaSki细胞后的FXR mRNA及蛋白表达水平

将DMSO及GW4064分别加入CaSki细胞培养基当中，分别于24和48 h提取mRNA和蛋白，检测FXR mRNA及蛋白表达水平。在CaSki细胞中，GW4064作用组FXR mRNA及蛋白水平均较DMSO组明显增加，差异具有统计学意义(图1，

P

＜0.05)。

图1 GW4064对CaSki细胞FXR mRNA和蛋白表达水平的影响

2.2 GW4064对CaSki细胞增殖的影响

CaSki细胞用GW4064处理24、48、72 h，通过MTT法检测细胞存活率，GW4064组较对照组均明显下降，差异均具有统计学意义(图2，

P

＜0.05)，提示GW4064激活FXR后可抑制CaSki细胞的增殖。

图2 GW4064对CaSki细胞增殖的影响

2.3 GW4064作用后CaSki细胞的凋亡率

流式细胞术检测GW4064对CaSki细胞凋亡的影响(图3，

P

＜0.05)。与对照组相比，GW4064作用组CaSki细胞的早期及晚期凋亡率均增加；随着时间推移，早期凋亡率减少，而晚期凋亡率增加。这表明，诱导细胞凋亡可能是FXR发挥抑制细胞增殖的机制之一。

图3 流式细胞术检测GW4064作用后CaSki细胞的凋亡率

2.4 GW4064作用后CaSki细胞p53蛋白的表达水平

通过Western blot检测GW4064作用CaSki细胞48 h后p53蛋白的表达水平。与DMSO组相比，GW4064作用组CaSki细胞中p53蛋白的表达水平升高，差异具有统计学意义(图4，

P

＜0.05)。

图4 GW4064对p53蛋白表达水平的影响

3 讨论

核受体家族与多种癌症发生发展有关，如肝癌、胰腺癌和胃癌等。我们前期的研究表明，与癌旁正常组织相比，孕烷X受体(pregnane X receptor，PXR)在宫颈癌组织中低表达，用PXR激动剂利福平及质粒转染过表达PXR可在体内及体外抑制宫颈癌细胞株的增殖。而PXR表达受到FXR受体调节，用胆酸或FXR激动剂GW4064喂养小鼠可造成强大的PXR诱导。在本研究中，FXR激动剂可在细胞水平抑制宫颈癌细胞株的增殖，证明激活FXR可在体外发挥抑制宫颈癌增殖的效应。

FXR通过调节肿瘤生长因子的表达和凋亡来影响癌细胞的增殖。在乳腺癌、睾丸癌、结肠癌等不同的肿瘤细胞株中，FXR激活均可引起细胞凋亡。FXR活化可通过激活某些信号通路，诱导细胞凋亡，从而影响肿瘤细胞增殖。FXR激活诱导宫颈癌细胞凋亡，可能与p53诱导凋亡有关。

p53

基因存在于染色体17p上，作为肿瘤抑制基因，控制细胞进入S期，p53在细胞增殖中起着重要的作用。p53突变抑制细胞增殖活性，与肿瘤增殖有关。p53肿瘤抑制因子在调节细胞生长、DNA修复和诱导细胞凋亡中起关键作用。本研究应用GW4064激活FXR，可以增加p53的蛋白表达水平，提示FXR激活至少部分通过增加p53表达对细胞凋亡发挥效应。

综上所述，FXR对CaSki细胞株发挥促凋亡、抗肿瘤生成的作用。说明FXR在宫颈癌发生中起重要调控作用，有可能成为宫颈癌治疗的潜在靶点。