烟气暴露30天对大鼠心脏基因表达谱的影响

李 梅，苏加坤，尹晶晶，徐 达，秦秀军，安 全，蔡继宝，*

(1．中国辐射防护研究院药物毒理与放射损伤药物山西省重点实验室，山西 太原030006；2．江西中烟工业有限责任公司，江西 南昌330096)

世界卫生组织指出，心血管疾病(cardiovascular disease，CVDs)已经成为威胁人类健康的重大疾病之一。吸烟是CVDs的可预防危险因素之一，是独立于年龄、高血脂、糖尿病、高血压等高危因素以外的心脑血管危险因素。当下比较肯定的是吸烟对血管的影响，例如血管内皮功能失调、促进动脉粥样硬化的发生以及发展等。但有关吸烟对心脏影响的研究较少，且大多仅局限于吸烟的急性效应。长期吸烟能够引起心脏形态学和功能学的改变，使心脏发生重塑。本文旨在研究烟气暴露对心脏基因表达谱的影响，从而证明其对心脏结构与功能的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠6只，9～10周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。生产许可证号SCXK-(京)2016-0006，质量合格证号11400700300671。大鼠饲养于屏障环境中，使用许可证号SYXK(晋)2013-0002。

1.2 卷烟和主要仪器

0号卷烟，由江西中烟工业有限责任公司生产，每支含烟碱1.0 mg，焦油10.0 mg，一氧化碳10.0 mg。

HRH-WBE3986型动物全身烟气暴露系统，购自北京慧荣和科技有限公司；Agilent Rat基因芯片，购自上海欧易生物医学科技有限公司；NanoDrop ND-2000，购自Thermo Scientific公司。

1.3 动物分组及处理

将大鼠随机分为对照组和烟气暴露组，每组3只。对照组不进行干预；烟气暴露组将大鼠放置于动物全身烟气暴露系统的烟腔内进行主流烟气暴露，烟气浓度控制在(1 100±110)mg/m，每天1次，每次60 min，30 d后剖杀，取对照组及烟气暴露组心脏进行检测分析。

1.4 芯片筛选

提取心脏总RNA，定量并检测RNA完整性。参照芯片标准操作，进行样本标记、芯片杂交及洗脱。首先，将总RNA反转录成cDNA，再进一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA。将标记好的cRNA与芯片杂交，洗脱，然后利用Agilent Scanner G2505C扫描得到原始图像。以上操作均由上海欧易生物医学科技有限公司完成。

1.5 数据分析

采用Feature Extraction软件处理原始图像，提取原始数据。利用Genespring软件对提取的原始数据进行处理。利用倍数变化(fold change，FC)值筛选差异基因，要求上调或者下调倍数变化值≥2.0且

P

≤0.05作为筛选的标准。在筛选差异基因前，先进行探针过滤，用于比较的每组样本中至少有一组100%标记为P(probe-name)的探针号留下进行后续分析。对于有生物学重复的分析，利用

T

检验得到的差异显著性

P

值和标准化信号的FC值进行筛选，标准为FC≥2.0且

P

≤0.05。对于无生物学重复的分析，仅利用FC值进行筛选，标准为FC≥2.0。在设生物学重复的情况下(即使用统计分析法分析差异表达)得出火山图，利用火山图展示差异表达情况。对筛选出的差异基因进行基因本体(gene ontology，GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库富集分析，以判定差异基因主要影响的生物学功能或者信号通路。

2 结果

2.1 差异表达基因情况

吸烟组筛选出差异表达2倍以上的基因共86个，其中上调表达基因60个，下调表达基因26个。散点图中除蓝色表示下调差异基因外，其他颜色散点均为上调差异表达基因，见图1。聚类分析结果见图2。色阶表示基因表达量从相对低(蓝)到相对高(红)变化，行名为探针名称，列为样本名称，连线表示样品两两之间的距离，构成距离矩阵，合并距离最近的两类为一新类，计算新类与当前各类的距离，再合并计算，直至有一类为止。聚在同一个簇中的基因可能具有相似的生物学功能。

图1 吸烟组大鼠心脏组织差异表达基因筛选散点图

图2 差异表达基因聚类分析结果

2.2 差异表达基因GO富集分析

根据GO分析对基因的注释，对烟气暴露组筛选出的86个差异表达2倍以上的基因采用生物学过程、细胞组分及分子功能进行分析。结果显示，86个差异表达基因富集于292种生物学过程，72种细胞组分和96类分子功能，其中差异显著的生物学过程112种，细胞组分11种，分子功能22类。图3～图5显示了生物学过程、细胞组分和分子功能3类富集分析差异显著性前20位条目。分子功能分析表明，差异表达基因主要涉及促分裂原活化蛋白激酶结合、镁离子结合、脱甲基化酶活性、乙醇结合、蛋白磷酸酶调节剂活性、趋 化 因 子(C-C基 元)受 体2(recombinant chemokine C-C-motif receptor 2，CCR2)结合、烟酸脱氢酶(nicotinic acid dehydrogenase，NAD)活性、免疫组化结合、催化活性、信号素受体结合、磷脂-5-磷酸结合、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)结合、小泛素相关修饰物(small ubiquitin-like modifier，SUMO)转移酶活性(图3)。细胞组分分析表明，差异表达基因主要涉及α-βT细胞受体复合物、凝聚染色体外型、染色质、细胞质、偏心异染色质、T细胞受体复合物(图4)。生物学过程分析表明，差异表达基因主要涉及细胞外渗的正调节、Wnt信号通路、平面细胞急性通路的正调节等(图5)。

图3 烟气暴露30 d后差异表达基因的主要分子功能分析

图4 烟气暴露30 d后差异表达基因的主要细胞组分分析

图5 烟气暴露30 d后差异表达基因的主要生物学过程分析

2.3 差异表达基因KEGG富集分析

对30 d烟气暴露组差异表达2倍以上的86个基因进行KEGG富集分析，结果显示，差异表达2倍以上基因涉及61条信号转导通路，其中差异显著的通路有9条(

P

＜0.05)。差异显著性排前10位的通路见图6，主要包括络氨酸代谢、细胞色素P450对异种生物学的代谢作用、类固醇激素生物合成、视黄醇代谢、造血细胞谱系、心肌炎、化学致癌、恰加斯病(美洲锥虫病)及非同源尾部链接。

图6 吸烟组大鼠心脏组织差异基因KEGG富集分析结果

3 讨论

吸烟严重影响着人民群众的健康，世界卫生组织最新报告显示，2019年全球约有13亿人吸烟，每年有490万人因吸烟而死亡，东南亚就占了110万，中国目前烟民有3亿多，其中年龄超过29岁的至少有1亿人因吸烟而付出生命代价。吸烟与多种心血管疾病的发生均有密切关系，其原因主要是因为烟草燃烧时可释放多种有毒有害化学物质，如尼古丁、酚类、醇类、醛类、焦油、CO、CO衍生的自由基、烷烃、多环芳烃等。这些有毒有害气体中，尼古丁和CO对心血管的影响最为重要，但其对心脏系统的损害机制尚不明确。有研究表明吸一支烟后可快速引起左心室舒张功能减弱。

本研究采用动物全身动态暴露系统将SD大鼠连续染毒30 d，取大鼠心脏，应用基因芯片技术进行差异表达基因筛选，探讨烟气暴露造成的差异表达基因可能的损伤机制。应用GO富集分析对差异表达2倍以上的86个基因进行分析，结果显示，染毒30 d基因表达的改变涉及到多种分子功能、细胞组分及生物学过程，主要包括促分裂原活化蛋白激酶结合、镁离子结合、脱甲基化酶活性、细胞受体复合物、染色体、染色质、细胞质、细胞外渗正调节、信号通路等。筛选出了促分裂原活化蛋白激酶，信号转导通路，细胞周期调控等相关差异基因。有关这些基因的序列分析及功能预测已有许多研究报道，如Castardeli等研究发现烟气暴露4个月的大鼠，与对照组相比较左心房(LA)、左心室(LV)、左心室体积指数(LVMI)均增大，左室短轴缩短率(FS)与心室射血分数(EF)降低，同时也引起心脏形态学及收缩功能的改变。大鼠长期暴露在烟气环境下能够使去甲肾上腺素(NE)及促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)增加。而MAPKs在心力衰竭、细胞肥大、心肌再灌注损伤的发病机制中起重要作用，其主导心肌细胞的存活和生长，MAPKs的活化预示烟气暴露对心脏功能的毒性损伤效应。心脏形态及功能的改变可由心肌损伤及负荷改变引起。心腔大小和LVMI的变化表明心脏形态学的改变，提示了患者心脏的重塑。心室功能降低是导致心脏重塑的一个重要原因，心室功能降低之初为了维持心脏功能，细胞代偿性增生，其后由于细胞生物化学、结构、基因等改变导致失代偿，心室功能进行性降低，从而形成心脏重塑。

KEGG富集分析结果显示，差异表达基因主要包括络氨酸代谢、细胞色素P450代谢、类固醇激素生物合成、视黄醇代谢、造血细胞谱系、心肌炎、化学致癌性等生物学通路。细胞色素P-450存在于心脏和冠脉循环中。吸食烟草和可卡因能诱导参与心肌梗死的细胞色素P-450，易增加心肌梗死发生率。有研究显示，缺血再灌注过程中选择性抑制细胞色素P-450，将是治疗心肌梗死的一条较有前景的途径。

本次研究发现蛋白激酶活化、细胞色素P-450差异表达显著，因此提示吸烟对心脏具有危害。烟气对心脏造成的影响是一个较复杂的过程，经常暴露在烟气环境下可加重心脏形态学改变、功能学改变的发生，使心脏功能下降，诱发心脏重塑，增加心血管疾病的发病率及病死率。心脏重塑是心力衰竭发生和发展的关键因素，临床主要表现为心脏功能减退、心腔扩大、心肌变薄或肥厚等。目前国内外对吸烟的慢性长期效应研究相对较少，吸烟对心脏影响的作用机制还需深入研究。

综上，本研究以烟气暴露30 d大鼠为对象，研究了烟气暴露30 d大鼠心脏基因表达谱的变化，筛选出了差异表达基因。这些基因涉及细胞周期、信号转导等多个生物学通路，这些通路的变化是相互影响及相互作用的结果。此次筛选出的结果将为进一步筛选吸烟差异基因以及研究吸烟损伤机制提供依据。