亚慢性硝酸钇暴露对雌性大鼠学习记忆能力的影响

王佳敏，刘建新，孟庆贺，郝卫东*

(北京大学公共卫生学院毒理学系，食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京100191)

稀土元素(rare earth elements，REEs)是指元素周期表中ⅢB族中的17种化学元素。稀土广泛应用于工业、农业、畜牧业、医药业等行业，是我国重要的战略资源。近几年，稀土元素在茶叶中的暴露情况受到广泛关注。稀土微肥通常作为叶面肥使用，农用稀土肥料主要采用较易溶解于水的稀土元素硝酸盐类化合物，使得稀土元素进入了各种茶叶中，农用稀土通过茶树的根茎等进入叶片部分进行富集并在叶片中残留，致使普通人群日益频繁地接触到稀土元素。研究表明茶叶中稀土元素铈(Ce)、镧(La)、钇(Y)的平均含量相对较高。

钇在地壳中的质量丰度约为33 mg/kg，是稀土元素中含量最丰富的元素之一。自然界40%的钇存在于中国，主要分布于中国东北、湖南、两广、滇川和西北。钇是第一个被发现的稀土金属元素，可用于制特种玻璃和合金。常见化合物是氧化钇和卤化钇，与其他元素化合主要呈正二价或正三价态，所形成的化合物具有高熔点、热稳定性好以及良好的发光辐射性能等特点。

以往关于稀土元素的神经毒性研究，关注镧元素较多，钇及其化合物相对较少。已有的一些研究发现，钇及其化合物能够破坏血脑屏障、促进神经细胞过度凋亡、改变神经递质含量、损伤学习记忆能力，对神经系统造成损伤。本研究通过观察硝酸钇亚慢性(90 d)暴露对大鼠学习记忆能力的影响，以谷氨酸(glutamate，Glu)及N-甲基-D-冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)蛋白表达为基础探究其可能的作用机制，旨在为稀土元素钇的风险评估提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

本研究的主要试剂有：硝酸钇(Ⅲ)四水合物[Yttrium(Ⅲ)nitrate tetrahydrate，Y(NO)·4HO，纯 度99.99%，上海西格玛奥德里奇贸易有限公司]，NMDA R1抗 体 和NMDA R2A抗 体(英 国Abcam公司)，NMDA R2B抗体、大鼠谷氨酸比色法测试盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(美国Cell Signaling Technology公司)，BCA蛋白检测试剂盒(中国赛默飞世尔科技有限公司)。

1.2 实验仪器

本研究使用的实验仪器有：高速冷冻离心机(Sigma 3-18KS型，德国Sartorius公司)；多功能组织匀浆仪(FastPrep-24型，美国MP Biomedicals公司)；超声细胞破碎仪(VIRSONIC 100型，美国VIRTIS公司)；垂直凝胶电泳系统(Mini-PROTEN Tetra cell型，美国Bio-Rad公司)；化学发光凝胶成像分析系统(MINI HD9型，英国UVITEC公司)；微量分光光度计(NanoPhotometer N50 Touch型，德 国IMPLEN公 司)；正置荧光显微镜(BX43型，日本Olympus公司)。

1.3 实验动物处理

选用刚离乳(PND21)的无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级SD大 鼠，质 量45～55 g，雌性，由北京大学医学部实验动物科学部提供，动物使用许可证号：SCXK(京)2016-0010。动物饲养于屏障环境中，温度20～25℃，相对湿度40%～70%。光照条件为12 h/12 h明暗交替循环，动物自由饮水及进食。动物实验符合动物福利和北京大学动物伦理委员会相关规定并通过伦理委员会审查。

参照经济合作与发展组织(OECD)GD-424推荐的动物神经行为毒性评价实验方法。大鼠在5 d适应期后，根据体质量随机分为4组，分别为对照组(ddHO)，Y(NO)低 剂 量 组(10 mg/kg)、中 剂 量 组(40 mg/kg)和高剂量组(160 mg/kg)，每组15只。

1.4 行为学实验

1.4.1 旷场实验

将体积为100 cm(长)×100 cm(宽)×50 cm(高)的旷场装置放置在隔音的房间内，严格控制室内温度和通风，选用弱光照明。实验者与设备保持一定距离。将动物放置于旷场中央，旷场地面被分成若干网格，记录5 min内动物的活动参数：水平运动距离、垂直运动距离、直立次数、梳理次数，以及动物的典型行为(如舔、咬等)的次数。分别以旷场中央和周围来计算以上指标，动物在中央的活动次数反映了焦虑程度，即中央活动次数越多焦虑越少。

1.4.2 高架十字迷宫

高架十字迷宫包括两个开放臂和两个封闭臂，四者形成十字的形状，每个臂长47 cm，宽15 cm，两个封闭臂有高40 cm的壁。动物置于迷宫中央，面向其中一个开放的臂。让动物自由探索四个臂5 min，记录动物第1次进入任何臂的潜伏期，以动物四肢都进入一个臂算作进入1次。每只动物只检测1次，如果在试验过程中动物跌落，则淘汰该数据。计算动物进入开臂次数和在开臂滞留时间分别占总次数(进入开臂和闭臂次数之和)和总时间(在开臂和闭臂滞留时间之和)的百分比，以此作为评价焦虑的指标。

1.4.3 转棒实验

转棒实验的装置为无顶木箱，箱内有可转动的防滑材质的转棒。试验前1 d，将大鼠置于转棒上以4 r/min的速度适应60 s，直到大鼠在转棒上60 s不跌落。测试当天，将大鼠置于转棒上，300 s内转速从4 r/min加速到40 r/min。记录大鼠从竿上跌落的旋转速度和潜伏期，并取3次试验的平均值。

1.4.4

Morris

水迷宫实验

实验装置放置在安静宽敞的房间内，在墙壁上悬挂一些圆形、三角形等物体作为动物的视觉线索。在设备周围拉上黑色围帘以阻隔实验者和受试动物。将实验装置分为4个象限，内注入自来水，水高23 cm，水温保持在(25.0±1.0)℃；于其中西北(NW)象限中心置一圆形平台，直径10 cm，位于水面下1.5～2.0 cm。实验包括：①定位航向实验：平台置于水面下1.5～2.0 cm，将大鼠随机地头朝池壁，按东北(NE)、西北(NW)、东南(SE)、西南(SW)4个入水点轻轻放入水池中。每次试验中每只大鼠最多游泳90 s，让其找到水中隐藏的平台，记录大鼠自入水至找到平台四肢爬上平台所需的时间，作为逃避潜伏期。大鼠爬上平台后，让其停留30 s；若入水后给定时间内未能找到平台或未能爬上平台，则将时间记录为90 s，并且将其人为放置于平台上30 s，然后从平台上取下休息30 s，再进行下一次训练。按此方法每只动物每天训练4次，连续训练4 d。②空间探索实验：最后一次定位航行实验后24 h，撤除平台。将动物从任一随机象限放入水中追踪其运动轨迹60 s，连续测试两次；记录动物目标象限(原先放置平台的象限)的游泳时间、游泳距离、进入目标象限的次数，以及穿过原平台位置的次数。

1.5 谷氨酸含量检测

行为学检测后，采用股动脉放血法处死动物，迅速断头取脑，冰上快速分离出大脑皮质和双侧海马，-80℃冰箱冻存待用。使用大鼠谷氨酸比色法测试盒，按照试剂盒说明书操作，检测雌鼠大脑皮质和海马中谷氨酸的含量。

1.6 N-甲基-D-天冬氨酸受体蛋白表达检测

采用Western blot法。取0.05 g海马组织加入300 μL RIPA(临用前按1∶100加入PMSF)，匀浆仪破碎组织，4℃14 000g离心5 min，取上清，PBS稀释后，用BCA法测定总蛋白浓度，-80℃冰箱冻存。经8% SDS-PAGE分离后，转膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，TBST缓冲液洗涤后，一抗稀释液孵育，4℃水平轻摇过夜。所用抗体滴度：β-actin、NMDA R2A、NMDA R2B均为1∶1 000，NMDA R1为1∶5 000。TBST洗涤后，抗兔二抗稀释液(滴度1∶2 000)室温下孵育2 h。ECL发光，运用化学发光凝胶成像分析系统采集图片，ImageJ软件测定条带像素值，以β-actin为内参蛋白，计算得到目的蛋白的相对表达量。

1.7 大鼠脑组织病理组织学检查

各暴露组取5只雌鼠，进行原位灌注后断头取脑，4%多聚甲醛溶液中浸泡固定脑组织24 h。经梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理后，对脑组织标本进行石蜡包埋，连续冠状切片后进行苏木精-伊红染色，光学显微镜下对脑组织进行组织病理学检查。

1.8 统计分析

数据以

x

ˉ±

s

表示，采用SPSS 22.0进行统计分析。采用双因素重复测量方差分析(two-way repeated measures ANOVA)比较定位航向实验的学习曲线(剂量组×训练天数)。对于其他指标数据的统计分析，各剂量组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，实验组与对照组间采用LSD-

t

检验进行两两比较。统计学检验水准为α=0.05，

P

＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学实验结果

见表1。硝酸钇90 d暴露后，旷场实验结果显示，与对照组相比，各硝酸钇暴露组大鼠的水平运动距离、直立次数、梳理次数、中央区运动时间差异均无统计学意义(

P

＞0.05)；高架十字迷宫实验结果显示，与对照组相比，各硝酸钇暴露组大鼠的进入开臂次数[进入开臂次数/(进入开臂次数+进入闭臂次数)]、进入开臂时间(进入开臂时间/总时间)、开臂中运动距离(开臂中运动距离/总运动距离)的百分比差异均无统计学意义(

P

＞0.05)；转棒实验结果显示，与对照组相比，160 mg/(kg·d)硝酸钇暴露组大鼠的在棒时间、在棒圈数、掉落速度均明显升高(

P

＜0.05)。

表1 硝酸钇90 d暴露对雌鼠行为学实验结果的影响(n=10)

2.2 Morris水迷宫实验结果

硝酸钇90 d暴露对雌鼠定位航向实验结果的影响如图1所示，随着训练时间的延长，与第1天相比，对照组及各硝酸钇暴露组大鼠的逃避潜伏期与总航行距离均明显降低(

P

＜0.05)。与对照组相比，训练第4天时，40、160 mg/(kg·d)硝酸钇暴露组大鼠逃避潜伏期明显缩短(

P

＜0.05)。

图1 硝酸钇90 d暴露对雌鼠定位航向实验结果的影响(n=10)

硝酸钇90 d暴露对雌鼠空间探索实验结果的影响如表2所示，与对照组相比，40 mg/(kg·d)硝酸钇暴露组大鼠穿越平台次数、目标象限游泳时间、目标象限游泳时间百分比(目标象限游泳时间/总时间)时间明显升高(

P

＜0.05)；160 mg/(kg·d)硝酸钇暴露组大鼠穿越平台次数、进入目标象限次数、目标象限游泳时间明显升高(

P

＜0.05)；各硝酸钇暴露组大鼠的目标象限游泳时间、目标象限游泳距离、目标象限游泳距离百分比(目标象限游泳距离/总游泳距离)、总游泳距离、游泳平均速度差异均无统计学意义(

P＞

0.05)。

表2 硝酸钇90 d暴露对雌鼠空间探索实验结果的影响(n=10)

硝酸钇90 d暴露对雌鼠空间探索实验各个象限结果的影响如图2所示，与目标象限NW象限的逃避潜伏期相比，对照组大鼠NE、SE象限的逃避潜伏期明显高于NW象限的逃避潜伏期(

P

＜0.05)；40 mg/(kg·d)硝酸钇暴露组大鼠SW象限的逃避潜伏期明显低于NW象限的逃避潜伏期(

P

＜0.05)；160 mg/(kg·d)硝酸钇暴露组大鼠NE、SW、SE象限的逃避潜伏期明显低于NW象限的逃避潜伏期(

P

＜0.05)。

图2 硝酸钇90 d暴露对雌鼠空间探索实验各个象限中结果的影响(n=10)

2.3 大鼠脑谷氨酸含量检测结果

硝酸钇90 d暴露对雌鼠大脑皮质及海马中Glu含量的影响如图3所示，与对照组相比，各硝酸钇暴露组大鼠大脑皮质中Glu含量差异均无统计学意义(

P＞

0.05)；而160 mg/(kg·d)硝酸钇暴露组大鼠海马中Glu含量显著降低(

P

＜0.05)。

图3 硝酸钇90 d暴露对雌鼠大脑皮质及海马中Glu含量的影响(n=10)

2.4 离子型谷氨酸受体蛋白表达检测结果

硝酸钇90 d暴露对雌鼠海马中NMDA受体R1、R2A、R2B蛋白表达的影响如图4所示，与对照组相比，40 mg/(kg·d)硝酸钇暴露组大鼠海马中NMDA受体R2A含量和160 mg/(kg·d)硝酸钇暴露组大鼠海马中NMDA受体R1、R2A含量均显著降低(

P

＜0.05)。

图4 硝酸钇90 d暴露对雌鼠海马中NMDA受体蛋白表达的影响(n=10)

2.5 大鼠海马组织HE染色结果

硝酸钇90 d暴露对雌鼠海马组织结构的影响如图5所示。在光学显微镜下进行病理组织学检查，与对照组相比，各硝酸钇暴露组海马组织均未见形态学异常现象，海马各区神经元呈圆形、椭圆形或锥形，细胞核为原型或椭圆形，着色均匀为浅蓝紫色，核仁明显，神经元数量正常；其中锥体细胞、齿状回颗粒细胞排列整齐，细胞轮廓于周围组织分界清晰。海马神经元形态基本完整，分布规则，数量无明显变化，细胞核未见明显异常。此结果提示硝酸钇90 d暴露不会对雌鼠海马组织造成病理学改变。

图5 硝酸钇90 d暴露对雌鼠海马组织结构的影响(×400)

3 讨论

Morris水迷宫由英国生理学家Morris于1984年发明，目的是用于评估啮齿动物的脑学习记忆，目前被广泛应用于评价动物的空间学习与记忆能力。本研究结果显示，定位航行实验的第4天训练中，与对照组相比，40、160 mg/(kg·d)剂量组雌鼠的逃避潜伏期均显著降低(

P

＜0.05)。空间探索实验中，与对照组相比，40、160 mg/(kg·d)剂量组雌鼠的穿越原平台所在位置次数、目标象限中游泳时间均显著升高(

P

＜0.05)，说明中、高剂量组雌鼠对原平台所在位置的记忆更加深刻。对于空间探索实验的逃避潜伏期，各剂量组雌鼠在不同象限中的停留时间有所差异。对照组雌鼠在目标象限中停留时间显著低于另外两个象限，而160 mg/(kg·d)剂量组雌鼠在目标象限中停留时间显著高于剩余3个象限，由此可见对照组雌鼠对原平台位置的记忆能力低于160 mg/(kg·d)剂量组雌鼠。本研究结果提示40、160 mg/(kg·d)剂量的硝酸钇亚慢性暴露可引起雌性大鼠空间学习记忆能力的增强，且随着暴露剂量的增高，大鼠的学习记忆能力也随之增高。学习和记忆是机体大脑的复杂神经生理活动，而海马对于空间记忆的产生与维持具有重要意义。海马中谷氨酸(Glu)是重要的兴奋性神经递质，可以激活突触后膜上NMDA受体(NMDARs)，此过程与神经元突触可塑性、学习记忆功能密切相关。一般认为，NMDA受体表达减少可能导致大鼠空间学习记忆能力的减弱，但本研究结果显示，硝酸钇的亚慢性(90 d)暴露促进了雌性大鼠的空间学习记忆能力，与对照组相比，160 mg/(kg·d)剂量组海马中Glu含量显著降低，40 mg/(kg·d)剂量组海马中R2A含量显著降低(

P

＜0.05)；160 mg/(kg·d)剂量组海马中R1、R2A含量显著降低(

P

＜0.05)，因此关于硝酸钇影响雌性大鼠学习记忆功能的机制仍需要进一步深入研究。另外，近年来由于NMDA受体过度活化与多种中枢神经系统疾病存在密切关系，对开发靶向NMDA受体的药物一直备受重视。多项研究表明，NMDAR拮抗剂在动物已经获得学习记忆后给药，在大鼠进行Morris水迷宫训练后，将NMDAR拮抗剂注入大鼠海马，可以提高大鼠在Morris水迷宫实验中的空间记忆能力。因此，抑制NMDA受体表达也有可能保护大鼠对空间学习记忆能力的维持，但是这与硝酸钇影响雌性大鼠神经行为功能的机制是否有关，仍需要进一步的探索。

本研究根据OECD424准则，评价硝酸钇对雌性大鼠学习记忆能力的影响，发现40、160 mg/(kg·d)剂量组雌鼠的空间学习记忆能力提高，160 mg/(kg·d)剂量组雌鼠海马组织中Glu含量与NMDA R1受体蛋白表达均显著降低；40、160 mg/(kg·d)剂量组雌鼠海马组织中NMDA R2A受体蛋白表达显著降低，提示硝酸钇亚慢性暴露引起雌性大鼠空间学习记忆能力增强的机制，可能与海马组织中Glu含量降低、NMDA受体表达减少有关。