基于网络药理学方法的加味黄芪赤风汤治疗IgA 肾病作用机制的研究

马思佳 赵明明 常美莹 余 怡 王如梦 张 昱

中国中医科学院西苑医院肾病科，北京 100091

IgA 肾病是世界范围内最常见的肾小球肾炎，以系膜区沉积免疫球蛋白A（IgA）为主要特点[1]。该病的发病机制较为复杂，现阶段仍不十分明确，因此找出最佳治疗方法是一个重大挑战。目前，IgA 肾病仍然是导致终末期肾病的主要原因之一[2-4]。既往临床上治疗IgA 肾病多会应用免疫抑制疗法，但近来有研究发现，对于正在进行综合支持治疗的，以中度蛋白尿和慢性肾脏疾病1～3 期为特征的IgA 肾病患者，采用增加免疫抑制的疗法并没有益处[1]。大量使用免疫抑制剂及激素虽在一定程度上可改善患者的症状，但均不足以阻断或逆转其病理发展，且存在容易产生耐药性，出现股骨头坏死、痤疮、脱发等副作用，加重患者不适感等弊端。而中医药在长期的临床实践基础上积累了不少治疗经验，经过研究证实，可有效改善患者症状，延缓肾脏病进展[5]。具有副作用小、易于接受的优势。因此，临床上许多患者经西药治疗后效果欠佳，多采用中药复方进行辅助治疗，以增强效果。

加味黄芪赤风汤是中国中医科学院西苑医院（以下简称“我院”）肾病科张昱教授及其团队，通过长期的临床运用，对中医药防治IgA 肾病进行观察、总结及研究所取得的成果，是基于该病“虚-风-瘀-毒”的病机，在清代医家王清任《医林改错》所载黄芪赤风汤的基础上加味而成，主要由生黄芪、赤芍、防风、金樱子、芡实、穿山龙、白花蛇舌草等组成[6]。临床应用本方治疗IgA 肾病常可收获满意效果[7]，本课题组前期采用真实世界研究的方法，收集2015 年1 月—2016 年12 月于我院门诊就诊的IgA 肾病并符合气虚血瘀症的患者295 例，以加味黄芪赤风汤治疗24 周后患者24 h蛋白尿水平及中医症状积分较治疗前下降，差异有高度统计学意义（P ＜0.01），总有效率达77%[7]。

中药具有多成分、多靶点的作用特点，因此在研究中药及其复方治疗某些疾病的作用机制时，难度会大大增加，而网络药理学的出现则在一定程度上为中药作用机制的细化研究提供了帮助。为深入挖掘加味黄芪赤风汤治疗IgA 肾病的潜在生物学机制，本研究通过筛选加味黄芪赤风汤的活性成分，预测活性成分的生物靶点，构建活性成分-疾病-靶点相互作用网络和IgA 肾病靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络等，从整体性观察加味黄芪赤风汤治疗IgA 肾病的潜在生物学机制，探讨其潜在的作用机制，分析其复杂网络关系，为其临床应用提供一定的理论依据[8]。

1 材料与方法

1.1 加味黄芪赤风汤活性成分收集与筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）将加味黄芪赤风汤中的主要组成药物分别输入TCMSP 进行成分检索，以口服生物利用度（OB）值≥30%、药物相似性（DL）值≥0.18 作为筛选条件，筛选出该方的活性成分。

1.2 加味黄芪赤风汤潜在作用靶点的预测

利用TCMSP 获取筛选出的加味黄芪赤风汤的每个活性成分对应的潜在靶点信息，借助Uniprot数据库除去没有相应靶点的成分，然后应用Perl 软件（V5.24.1）为筛选出的靶点添加基因名及规范靶点的基因名。

1.3 IgA 肾病相关靶点的获取

在GeneCards 数据库和人类孟德尔遗传数据库（OMIM）中以“IgA nephropathy”为关键词检索，得到有关IgA 肾病的相关靶点信息。

1.4 中药-IgA 肾病靶点的构建

利用R 语言（V3.6.2）计算出加味黄芪赤风汤活性成分靶点和IgA 肾病交集的靶点，从而得到中药复方-IgA 肾病的共同靶点，将映射结果以韦恩图的形式绘制出来。

1.5 加味黄芪赤风汤活性成分-疾病-靶点调控网络的构建

运用Perl 软件将“1.1”项下获得的加味黄芪赤风汤中的活性成分和“1.4”项下获得的中药复方-IgA 肾病靶点进行一一映射，借助Cytoscape 软件（V3.7.0）进行绘图，构建出加味黄芪赤风汤各中药-有效成分网络图及加味黄芪赤风汤活性成分-疾病-靶点调控网络图。之后利用该软件的分析功能以Degree 值作为拓扑分析的主要参考依据，筛选排名靠前的靶点作为核心靶标，从而绘制出核心靶点的柱状图。

1.6 构建中药-IgA 肾病靶点蛋白的PPI 网络

将筛选得到的中药-IgA 肾病靶点蛋白以文本形式上传至String 在线软件，筛选条件种属选择为人类，进行PPI 网络预测，保存相应结果文本文件及图形。

1.7 GO 功能和KEGG 通路富集分析

借助R 语言软件对得到的中药-IgA 肾病靶点进行相应计算，得到相关的GO 功能和KEGG 通路富集分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义，绘制相应的柱状图和气泡图。

2 结果

2.1 加味黄芪赤风汤有效成分筛选汇总

在TCMSP 数据库中根据OB、DL 值筛选后共得到了85个关于加味黄芪赤风汤的有效化学成分，其中7个来自白花蛇舌草，3个来自穿山龙，28个来自赤芍，18个来自防风，20个来自黄芪，7个来自金樱子，2个来自芡实，排除重复部分，共45个活性成分。

2.2 中药-IgA 肾病靶点构建的结果

在GeneCards数据库中获取到1252个潜在作用靶点，在OMIM 中获取到31个潜在作用靶点，将两者汇总后，利用R 语言软件将疾病相关靶点与加味黄芪赤风汤有效活性成分靶点取交集，绘制出中药-IgA肾病共同靶点的韦恩图，其中95个为疾病与中药复方重合作用的靶点，IgA 肾病相关靶点为1283个，加味黄芪赤风汤有效作用靶点为228个。见图1。

图1 加味黄芪赤风汤与IgA 肾病相关的韦恩图

2.3 加味黄芪赤风汤活性成分-疾病-靶点网络的构建

通过收集加味黄芪赤风汤活性成分的靶点和IgA肾病的相关靶点，在Cytoscape 中构建出该方成分-疾病-靶点的网络图，如图2 所示，倒三角形代表中药名称，长方形代表加味黄芪赤风汤中各中药具有的有效成分，成分和靶点之间的相互作用以边表示。加味黄芪赤风汤活性成分-疾病-靶点网络图如图3 所示，该网络图中共有141个节点与366 条边，倒三角形节点代表加味黄芪赤风汤中有效成分，圆形节点代表IgA肾病与该复方共同作用的靶点。由图3 可知，存在一个成分与多个靶点相交或多个成分与一个靶点相交的现象，证实了加味黄芪赤风汤是在多成分、多靶点的基础上辅助治疗IgA 肾病的。选取Cytoscape 中的Network-Analyzer 选项，对节点的Degree 值及相关参数进行网络拓扑分析，找到了节点Degree 值排名前10 位的基因作为核心靶标，其中包括白蛋白（ALB），白细胞介素-6（IL-6），丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1），血管内皮生长因子A（VEGFA）等，以数字代表节点Degree 值，这些靶点可作为加味黄芪赤风汤治疗IgA肾病的潜在靶点以进行进一步研究。见图4。

图2 加味黄芪赤风汤各中药-有效成分网络图

图3 加味黄芪赤风汤活性成分-疾病-靶点网络图

图4 加味黄芪赤风汤活性成分-疾病-靶点网络中Degree 值排名前10 的活性成分

2.4 交集基因编码蛋白相互作用网络图的构建

在String 数据库中导入加味黄芪赤风汤与IgA肾病的交集靶点，得到中药-IgA 肾病交集靶蛋白的PPI 网络图，其中，节点表示蛋白，连线表示蛋白之间存在联系。见图5。

图5 加味黄芪赤风汤治疗IgA 肾病的蛋白质-蛋白质相互作用网络图

2.5 GO 功能富集分析

加味黄芪赤风汤治疗IgA 肾病核心靶标的GO功能富集分析的柱状图见图6（封四）。该复方治疗IgA 肾病可能主要是通过细胞因子受体结合、抗氧化、抑制转录因子结合等过程实现的。

图6 加味黄芪赤风汤治疗IgA肾病的GO富集分析

2.6 KEGG 功能富集分析

加味黄芪赤风汤治疗IgA 肾病的核心靶标KEGG 通路富集分析的气泡图见图7（封四）。该复方主要是通过干预AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路和人类巨细胞感染通路、HIF-1 信号通路等治疗IgA 肾病的。

图7 加味黄芪赤风汤治疗lgA肾病的KEGG通路富集分析

3 讨论

IgA 肾病最早由Berger 和Hinglais 于1968 年提出，是一种被定义为以IgA 在肾小球内沉积占主导地位的肾小球肾炎[9]。临床发病以20～30 岁多见，亚洲发病率高于全球其他地区[10]。大量的IgA 与补体在肾内沉积，会引起肾小球系膜细胞增生、肾小球节段硬化或粘连、毛细血管内细胞增多、肾小管萎缩和肾间质纤维化等，从而进一步损伤肾脏功能[11]。越来越多的研究表明，大部分的IgA 患者最终会进展为肾衰竭。由于IgA 肾病的具体发病机制较为复杂，目前仍不明确，因此，如何降低蛋白尿，减轻肾脏负担，改善病理损伤，延缓病情发展成为治疗该疾病的首要任务和相关领域的研究热门。

由于中药复方成分、靶点、机制复杂的客观难题，使得传统药理学方法很难从整体性的角度观察和探讨加味黄芪赤风汤的潜在生物学机制，尤其是相互关联的生物分子网络的调控[8]。通过某个特定靶点往往不能有效地干预或控制IgA 肾病的进程，而中药复方的组合形式往往多种多样，每一味药物中含有的有效活性成分不同，具有多成分、多靶点、多通路的作用特点，在治疗IgA 肾病这类由多种病理机制共同影响的疾病时，往往是重要的干预措施。黄芪赤风汤首载于清代王清任的《医林改错》，方中包含生黄芪、赤芍、防风三味药，具有益气通阳、活血行滞、祛风通络的功效。张昱教授精研其方，认为该方与慢性肾病本虚标实，虚-风-瘀-毒的病因病机特点不谋而合，诸药配伍共奏健脾补肾、益气活血、祛风解毒之功，虚实兼顾，标本同调[12-13]。

本研究借助网络药理学相关平台，应用生物信息学对加味黄芪赤风汤进行网络构建，探究加味黄芪赤风汤治疗IgA 肾病的作用机制。本研究共筛选出主要包括槲皮素、β-谷甾醇、黄芩苷元、山柰酚等在内的45个有效活性成分，其可能通过影响ALB、IL-6、AKT1、VEGFA等潜在靶点，发挥治疗IgA 肾病的关键作用。后续通过IgA 肾病相关靶点的PPI 预测和GO 生物功能及KEGG 通路富集分析，发现该方可能主要通过AGE-RAGE 信号通路、前列腺癌通路、乙型肝炎通路、IL-17 信号通路等，干预磷酸酶结合、血红素结合、细胞因子受体结合、细胞抗氧化、抑制转录因子结合等生物过程，从而发挥其保护肾脏功能，改善病理损伤等作用来治疗IgA 肾病。

前期已有大量的临床研究证实了加味黄芪赤风汤中的各类中药有效成分可有效延缓IgA 肾病患者肾功能恶化，保护患者肾功能[14-16]。而加味黄芪赤风汤治疗IgA 肾病的网络药理学分析结果也与之前众多实验的研究结果相契合。叶苗等[17]发现，应用槲皮素可使血清炎症因子显著降低，其可能通过抑制炎症反应和缓解细胞凋亡起到保护肾脏，使其免受缺血再灌注损伤的作用。黄芩苷可有效改善糖尿病大鼠的肾功能，降低细胞外基质（ECM）沉积，修复损伤的肾小球足细胞并减轻局部的炎症反应[18]，山奈酚[19]可有效抑制高糖引起的大鼠肾系膜细胞p38MAPK 蛋白的磷酸化，减少肾细胞膜细胞增殖。毛蕊异黄酮可保护肾小球，增加肾脏血液灌注量，改善肾脏血流动力，具有抗肾脏组织纤维化的作用[20]。有相关研究表明[21-23]，在伴有营养不良和炎症的终末期肾病患者中，炎症的发生可能于激活AGE-RAGE 信号通路后，导致血清可溶性黏附分子水平升高有关。此外，VEGF 在新生血管生成和血管高通透性中也起着重要作用，其不但会使局部新生血管内皮增生，还参与局部氧化应激反应及炎症反应，破坏肾小管上皮细胞的完整性，使肾小管上皮细胞的重吸收功能受损，导致患者出现不同程度的电解质紊乱[24-26]。IL-17 是具有较强促炎作用的物质，可以诱导其他细胞因子，促进炎症细胞募集，促进T 细胞浸润，诱导炎症反应发生，加重肾组织损伤。有研究表明IL-17 参与了IgA 肾病的发病过程[27]，患者肾小管间质及外周血中IL-17 表达增高，并与临床及病理预后指标密切相关，提示IL-17 可能是参与IgA 肾病发病及进展的因素之一。芍药苷可以作用于TNF 信号通路，有抑制炎症反应及抵抗细胞坏死和纤维化的作用[28]，且其还具有降低IL-17 在人体内表达的作用[29]。人巨细胞病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒感染在IgA 肾病的发生与发展过程中都发挥着重要的作用。冯晓丽[30]发现人巨细胞病毒多表达于肾小球及肾小管；肾小管、肾小球间质破坏程度与人巨细胞病毒抗原表达水平变化呈正相关；乙型肝炎病毒在肾小管上皮细胞内的表达水平较高，也有微量表达于肾间质、肾小球内。人巨细胞病毒感染会下调内皮细胞和细胞滋养层的金属蛋白酶-9（MMP-9）活性，特异性地降低MMP-9 的表达和活性[31]。在IgA 肾病中，MMP-9在系膜增殖性肾小球和间质血管壁的表达均明显增多，导致肾小球结构过度重塑，使ECM 过度聚积，形成蛋白尿，加重肾脏组织损伤，这可能是影响IgA 肾病进展的因素之一[32]。

综上所述，本研究采用网络药理学的方法，初步研究了加味黄芪赤风汤治疗IgA 肾病的作用机制，主要是发挥其多成分、多靶点、多通路的方式，协同作用，保护肾脏功能，延缓病理损伤。为后续进一步研究加味黄芪赤风汤辅助治疗IgA 肾病的作用机制奠定了研究基础，为临床上合理应用加味黄芪赤风汤提供了理论支持，具有重大意义。但是其具体的有效成分与详细的作用机制还有待于更深入、更细化的挖掘与讨论，并需要进行相关实验佐证。