UBD 在哈、维、汉三民族食管鳞癌组织中的表达及临床病理学意义

罗枭磊 卡吾力·居买 孙清超 李德生 买地尼也提·尼亚孜 张力为 伊力亚尔·夏合丁

1.新疆医科大学第一附属医院胸外科，新疆乌鲁木齐 830054；2.新疆维吾尔自治区食管癌研究所，新疆乌鲁木齐 830054；3.新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院，新疆乌鲁木齐 830054

食管癌是中国第六大癌症，也是第四大癌症死因，我国95%以上的食管癌为食管鳞状细胞癌[1-2]。新疆是我国食管癌高发区之一，新疆食管癌发病率由高到低依次为哈萨克族、维吾尔族和汉族[3]。泛素样蛋白D（ubiquitin D，UBD），又称人白细胞抗原FAT10（human leukocyte antigen-F adjacent transcript 10，HLA-FAT10），属于泛素样蛋白家族中的一员，具有和泛素相似的性质、结构，能够直接介导蛋白酶体降解途径[4-5]。UBD在神经、消化、泌尿系统等多种恶性肿瘤中均检测到其高表达现象[6]。文献报道部分肿瘤中高表达的UBD能够促进恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移能力和放、化疗抵抗性[7-11]，但其在食管鳞癌中的表达及临床病理意义尚不明确。本研究采用PCR、免疫组织化学法、HE染色检测UBD 在哈萨克族、维吾尔族和汉族3个民族食管鳞癌患者癌组织及癌旁组织中的表达情况，结合患者临床病理资料探讨其对不同民族食管鳞癌的影响及其临床相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2011 年1 月—2014 年12 月在新疆医科大学第一附属医院（以下简称“我院”）收治并行食管癌根治术的患者。收集173 例食管癌患者的癌组织和癌旁正常组织（距癌组织＞5 cm 的正常食管黏膜组织），其中哈萨克族43 例，维吾尔族58 例，汉族72 例；年龄38～83 岁，中位年龄64 岁；男119 例，女54 例。肿瘤分期按第7 版UICC/AJCC 食管癌分期标准进行，组织学分类及分化程度据世界卫生组织2010 年肿瘤组织学分类标准进行分级[12]。纳入人群为食管鳞癌患者，来我院就诊前未接受其他特殊治疗及放、化疗等。所有患者在签署知情同意书后留取标本，本研究通过我院医学伦理委员会的审查标准。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法及HE 染色 食管鳞癌组织及癌旁组织经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片后进行免疫组织化学染色（EnVision 两步法）及HE 染色。兔抗人UBD 单克隆抗体（ab192581）购自Abcam 公司，二抗通用型试剂盒（PV-6000）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。经过预实验一抗浓度选用1∶100，阴性对照用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液，用宫颈癌阳性组织切片为阳性对照。步骤依次为抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、加一抗4℃冰箱孵育、次日加二抗37℃恒温箱孵育、加DAB 显色剂、苏木精复染、脱水、封片及镜检拍照。镜检采用双盲法，由2 名高年资病理科医师完成，每例切片均应分别对超过100个观察细胞数的高倍镜视野进行独立评价，且高倍镜视野不能少于5个（400×）。UBD 蛋白低表达与高表达的判定标准：结果由以下2 项评分的乘积来判定。①以切片中细胞着色深浅评分：细胞无着色为0 分，浅黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分；②以阳性细胞数在同类细胞数中所占百分比评分：无阳性细胞为0 分，阳性细胞占比1%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%～75%为3 分，＞75%～100%为4 分。2 项乘积为最终得分。得分≤4 分定义为低表达，得分＞4 分定义为高表达。

1.2.2 实时荧光定量PCR 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测食管癌及癌旁组织中UBD mRNA表达水平。定量实验使用（TaKaRa）宝生物工程有限公司（中国，大连）试剂盒完成。第一链反转录使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（perfect real time）第一链合成试剂盒（RR047A）荧光定量检测使用abm®EvaGreen qPCR MasterMix-no dye 试剂盒。引物序列由陕西艾优稷生物科技有限公司设计。见表1。采用Trizol 法提取食管癌组织和癌旁组织的总RNA，经反转录获得cDNA，以H-actin 为内参，进行实时PCR 检测。反应条件：在95°C 下起始模板变性10 min，在94°C 下变性15 s，在60°C 下退火、延伸1 min，总共进行45个循环。PCR 反应体系由以下试剂或溶液组成：SYBR mix 10 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 1 μL 和蒸馏水7 μL。以H-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算UBDmRNA的相对表达水平。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件对所得数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，两组间采用t 检验，多组间比较采用方差分析。计数资料以例数或百分比表示，采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同民族食管癌鳞患者癌组织与癌旁组织中UBD mRNA 表达情况

不同民族癌及癌旁组织UBD mRNA 表达比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。三个民族癌组织中UBD mRNA 的表达水平高于对应癌旁组织，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 不同民族食管癌患者癌组织与癌旁组织中UBD mRNA 表达情况比较（）

表2 不同民族食管癌患者癌组织与癌旁组织中UBD mRNA 表达情况比较（）

注：UBD：泛素样蛋白D

2.2 不同民族食管鳞癌患者UBD 的表达情况

本研究中173 对组织切片免疫组化及HE 染色结果显示，UBD 在单民族食管鳞癌癌组织和对应癌旁组织中的表达均有差异，癌组织中较癌旁组织高表达，差异有统计学意义（P ＜0.05）。而UBD 在食管癌组织及癌旁正常组织的表达情况，不同民族比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表3、图2。

图2 UBD 在食管鳞癌癌组织及癌旁组织中的表达

表3 不同民族食管鳞癌患者UBD 的表达情况比较[例（%）]

2.3 UBD 在食管鳞癌中的临床病理学意义

UBD 的表达与肿瘤TNM 分期、N 分期、分化程度及神经脉管侵犯有关（P ＜0.05）。而UBD 表达与性别、年龄、T 分期、肿瘤大小和肿瘤部位等无关（P ＞0.05）。见表4。

表4 UBD 蛋白表达与食管癌患者临床病理特征的关系[例（%）]

3 讨论

自从1996 年UBD 被发现以后，已有大量的报道证实了UBD 在肝癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、胶质瘤等多种肿瘤组织中均存在高表达情况。UBD 在肝癌中的高表达率甚至达90%[13]。UBD 目前在食管癌中的研究较少，新疆地区作为食管癌高发病区，进一步增加对该疾病的了解意义重大[14]。本研究结果显示，UBD在癌组织中蛋白阳性表达率为42.8%，高于癌旁正常食管组织（12.7%），差异有统计学意义（P ＜0.05）。提示UBD 可能与食管癌密切相关，与诸多肿瘤相关研究结论相一致[15-16]。

本研究结果显示，低分化患者的UBD 蛋白的高表达在食管癌分化程度、N 分期、神经脉管侵犯及TNM分期方面存在差异性，提示UBD 过表达与多民族食管癌患者具有相关性。本研究显示，UBD 在食管鳞癌中具有促进食管鳞癌细胞转移及侵袭潜能的可能性，进一步促进了食管癌的恶性发展。

UBD 肿瘤研究相关文献发现，UBD 在多种恶性肿瘤中均具有促进肿瘤细胞侵袭及转移的能力。①UBD促进肝癌细胞的侵袭能力：同源框基因B9（HOXB9）是Ⅰ类同源盒基因的一员，在胚胎发育及肢体形成中起着重要作用，HOXB9 的过度表达与肝癌的肿瘤大小以及血管侵袭能力有关，UBD 表达上调可通过非共价结合β 连环蛋白（β-catenin）阻止其泛素化和随后被蛋白酶体降解，从而稳定β-catenin/TCF4 信号通路诱导HOXB9 的表达增加，增强肿瘤细胞的侵袭能力[17-18]。②UBD 促进骨肉瘤细胞的侵袭和转移能力：UBD 在骨肉瘤中也存在高表达现象，特别是在转移性骨肉瘤中，其高表达与骨肉瘤患者预后不良相关。此外，沉默UBD 骨肉瘤细胞的侵袭和转移能力受到明显抑制移[19-20]。③UBD 促进肺鳞癌细胞的侵袭能力：在肺鳞癌中，UBD 可增强Hsp90/Akt 信号通路表达，促进肺鳞癌细胞增殖，增强肿瘤细胞的侵袭能力[21]。④UBD 促进乳腺癌的转移能力：锌指E 盒结合同源盒蛋白2（ZEB2）的表达增强被认为可以促进乳腺癌的转移，UBD 可以直接与ZEB2 结合降低其泛素化，增强ZEB2 在乳腺癌细胞中的蛋白质稳定性，从而间接增强乳腺癌细胞转移能力[22-23]。⑤UBD 参与上皮-间质转化发生过程：上皮-间质转化能够赋予细胞转移和入侵的能力，研究发现UBD 激活AKT/Gsk3β 信号通路后可上调β-catenin 的表达及胞核转位，βcatenin 入核后可以调控与细胞增殖和细胞周期相关的蛋白，如细胞周期蛋白D1、原癌基因蛋白质等，同时其还可以通过促进波形蛋白表达和抑制上皮型钙黏附素（E-cadherin）表达而诱导上皮-间质转化发生。此外，UBD 还可通过激活AKT/GSK3β 信号通路来调控E-cadherin 的上游调节蛋白，如锌指蛋白和smad2/3等的表达，最终导致E-cadherin 的表达降低和上皮-间质转化发生[24-26]。UBD 在恶性肿瘤发病及侵袭转移中的以上机制，可能在食管鳞癌中也发挥着同样的作用。

综上，UBD 在食管癌的发生、发展中可能具有重要影响作用，本研究探讨了UBD 在3个民族食管鳞癌患者中的表达情况与临床病理资料的相关性，后期将继续结合患者生存资料进行生存分析，并观察UBD在体内外对食管鳞癌的影响，从而进一步阐明UBD在食管鳞癌发生、发展、侵袭、转移中的具体机制。UBD可能成为食管鳞癌潜在的治疗靶点或早期诊断、预后判断的分子标志物。