大黄牡丹汤联合柳氮磺胺吡啶肠溶片对溃疡性结肠炎小鼠氧化应激及Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1-核因子E2相关因子2信号通路的影响※

满光亮 刘永艳 梁国强

(江苏省昆山市第四人民医院消化科,江苏 昆山 215300)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)属于炎症性肠病的一种常见类型，临床表现为腹泻、黏液脓血便、腹痛等，且容易反复发作，对患者的生活质量造成严重影响[1]。UC的发病机制尚不十分明确，有研究认为其发病与遗传、环境、免疫等多种因素相关，其中氧化应激也是UC发病的重要机制之一[3]。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1-核因子E2相关因子2(Keap1-Nrf2)信号通路是细胞氧化应激反应中的关键通路，其调控的下游二相代谢酶和抗氧化蛋白酶在细胞防御保护中发挥着重要作用，也是近几年抗氧化研究领域的热点[4]。中医药在UC的治疗方面具有独特优势，认为UC的发生多是因脾虚失运，湿热熏蒸，气血相搏结，导致肠道气凝血滞，腐败成脓下所致[5]。大黄牡丹汤源自《金匮要略》，具有泻热逐瘀、消肿散结、凉血止血的功效。有研究表明，大黄牡丹汤可通过抑制炎性反应对UC发挥治疗作用[6]。为进一步发挥中医优势，探索大黄牡丹汤治疗UC的机制，本研究观察大黄牡丹汤联合柳氮磺胺吡啶肠溶片对UC小鼠氧化应激及对Keap1-Nrf2信号通路的影响，结果如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级BALB/c小鼠50只，雄性，周龄6～8周，体质量18～20 g，由昭衍(苏州)新药研究中心有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(苏)2018-0006。

1.2 主要药物 大黄牡丹汤：大黄12 g，牡丹皮9 g，桃仁12 g，冬瓜仁30 g，芒硝9 g(均采用江阴天江药业有限公司生产的中药颗粒剂)；葡聚糖硫酸钠盐(美国MPBIO公司)；柳氮磺胺吡啶肠溶片(上海信谊天平药业有限公司，国药准字H31020557)。

1.3 主要试剂 苏木素—伊红(HE)染色试剂盒(鸿泉生物科技有限公司)；小鼠活性氧(ROS)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒、小鼠髓过氧化物酶(MPO)ELISA试剂盒、小鼠丙二醛(MDA)ELISA试剂盒、小鼠总抗氧化能力(T-AOC)ELISA试剂盒及小鼠谷胱甘肽(GSH)ELISA试剂盒(上海邦奕生物科技有限公司)；Anti-Keap1抗体、Anti-Nrf2抗体及其相关免疫组化检测试剂盒(英国Abcam公司)。

1.4 主要仪器 CX41生物显微镜(日本OLYMPUS公司)；数码相机[NIKON(D5100)公司]；Infinite F50酶标仪(瑞士Tecan公司)；Image pro plus 6.0图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)；低温冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)。

1.5 实验方法

1.5.1 造模、分组及给药方法 将50只小鼠适应性喂养1周后，按照随机数字表法分为空白组、模型组、西药组、中药组及中西药组，每组10只。除空白组外，其余各组小鼠参照文献[7]采用葡聚糖硫酸钠盐诱导制备UC模型，连续饮用5%葡聚糖硫酸钠盐溶液7 d即可建立小鼠UC模型。造模成功观察3 d后，空白组及模型组予双蒸水灌胃10 mL/kg灌胃，西药组予柳氮磺胺吡啶肠溶片药液0.8 g/kg灌胃，中药组予大黄牡丹汤颗粒剂5.7 g生药/kg灌胃，中西药组上午予柳氮磺胺吡啶肠溶片药液灌胃，下午予大黄牡丹汤颗粒剂灌胃，灌胃剂量分别同西药组和中药组，均每日1次，连续灌胃7 d。

1.5.2 标本的采集和处理 各组大鼠末次灌胃后禁食不禁水24 h，然后颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，游离结肠及远端回肠，取出肛门至盲肠末端的整个肠段，迅速沿着肠系膜纵轴剖开，刮取收集肠内容物(黏膜黏液)，-80 ℃保存备用。再用预冷0.9%氯化钠注射液漂洗干净，将结肠平展开，仔细观察肠道溃疡和炎症情况，剪取溃疡最严重处结肠组织约1.5 cm，等分2份,一份-80 ℃保存备用，另一份用4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，备用。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 一般情况 观察各组小鼠灌胃期间的一般情况，包括精神状态、毛色、体质量、排便等，并根据小鼠粪便性质及隐血情况对灌胃后疾病活动指数(DAI)评分进行比较[8]。0分：大便正常，隐血阴性；1分：软便，隐血阴性；2分：软便，隐血阳性；3分：腹泻，隐血阳性；4分：腹泻，血便。

1.6.2 结肠组织病理学观察 各组小鼠随机取5个结肠组织切片样本进行HE染色，然后在生物显微镜下(×400)观察小鼠结肠组织病理变化情况，并进行结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分比较，包括溃疡、炎症、肉芽组织、病变深度及纤维化5个方面，评分越高说明损伤越严重[9]。

1.6.3 Keap1和Nrf2蛋白表达检测 各组小鼠随机取5个结肠组织切片样本进行免疫组化染色，然后计算小鼠结肠组织Keap1和Nrf2蛋白表达的平均光密度值。首先按照Keap1和Nrf2的免疫组化检测试剂盒说明进行免疫组化染色，然后在生物显微镜下(×200)观察阳性染色，截图，再用Image pro plus 6.0图像分析软件分析Keap1和Nrf2蛋白表达的平均光密度值。

1.6.4 氧化应激指标 取各组小鼠备用肠内容物及结肠组织，称质量，分别加入9倍质量的磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，再用低温冷冻离心机以3 000 r/min，4 ℃，离心10 min，分别采用ELISA测定肠内容物ROS水平和结肠组织MPO、MDA、T-AOC、GSH水平，均严格按照试剂盒说明进行。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况及DIA评分比较 空白组小鼠灌胃期间精神状况好，饮食、饮水及排便情况均正常，活动敏捷，毛发顺滑光亮，体质量随时间正常性增长。模型组小鼠随着时间增加饮食、饮水逐渐减少，毛发杂乱，精神状态差，出现持续性松散血便，体质量下降。西药组、中药组和中西药组在灌胃给药前一般状况表现与模型组一致，在灌胃治疗后上述症状均有所改善。另外，实验过程中模型组有2只小鼠死亡，西药组和中药组各有1只小鼠死亡，分析原因主要与造模相关，与文献报道存在一定的死亡率相一致[7]。各组小鼠灌胃后DIA评分比较 见表1。

表1 各组小鼠灌胃后DAI评分比较 分，

由表1可见，与空白组比较，模型组小鼠DAI评分升高，比较差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，中药组和中西药组小鼠DAI评分均降低，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，西药组虽也有下降但比较差异无统计学意义(P>0.05)。西药组、中药组和中西药组小鼠DAI评分组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组小鼠结肠组织病理学观察及CMDI评分比较 空白组小鼠结肠组织黏膜完整，腺体排列整齐，未见溃疡。模型组小鼠结肠黏膜有缺损，腺体结构分离，大量中性粒细胞浸润，出现炎性反应，可见肉芽组织增生及纤维化，病变深度集中在肌层及浆膜层，说明已经造成了结肠黏膜深层损伤。相对模型组，西药组、中药组和中西药组结肠组织的病理学表现均有不同程度的改善。见图1。各组小鼠CMDI评分比较 见表2。

由表2可见，与空白组比较，模型组小鼠CMDI评分升高，比较差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，西药组、中药组和中西药组小鼠CMDI评分均降低，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与西药组和中药组比较，中西药组小鼠CMDI评分均降低，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，西药组与中药组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组小鼠CMDI评分比较 分,

2.3 各组小鼠结肠组织Keap1和Nrf2蛋白平均光密度值比较 见表3、图2、图3。

由表3可见，与空白组比较，模型组小鼠结肠组织Keap1和Nrf2蛋白平均光密度值的升高，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，西药组、中药组和中西药组Keap1蛋白平均光密度值均降低，比较差异均有统计学意义(P<0.05),西药组Nrf2蛋白平均光密度值有下降趋势，中药组和中西药组Nrf2蛋白平均光密度值有增高趋势，但比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与西药组比较，中西药组Keap1蛋白平均光密度值降低，Nrf2蛋白平均光密度值升高，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与中药组比较，中西药组Keap1蛋白平均光密度值降低，比较差异有统计学意义(P<0.05)，Nrf2蛋白平均光密度值有升高趋势，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 各组小鼠结肠组织病理观察(HE，×400)

表3 各组小鼠结肠组织Keap1和Nrf2蛋白平均光密度值比较

图2 各组小鼠结肠组织Keap1蛋白表达情况(免疫组化，×200)

图3 各组小鼠结肠组织Nrf2蛋白表达情况 (免疫组化，×200)

2.4 各组小鼠ROS、MPO、MDA和T-AOC、GSH水平比较 见表4。

表4 各组小鼠ROS、MPO、MDA和T-AOC、GSH水平比较

由表4可见，与空白组比较，模型组小鼠ROS、MPO和MDA水平均升高，T-AOC水平降低，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，GSH水平有下降趋势，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，西药组、中药组和中西药组ROS和MDA水平均降低，T-AOC水平均升高，西药组和中西药组MPO水平均降低，中药组和中西药组GSH水平均升高，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，中药组MPO和西药组GSH水平与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与西药组比较，中西药组ROS和MDA水平均降低，T-AOC和GSH水平均升高，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，MPO水平有升高趋势，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。与中药组比较，中西药组ROS、MPO和MDA水平均降低，T-AOC水平升高，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，GSH水平有升高趋势，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

UC又称为慢性非特异性溃疡性结肠炎，是一种多因素、多层次、病因不明的非特异性肠道炎症，临床表现为腹痛、腹泻、里急后重、黏液脓血便等消化道症状，以及发热、水电解质紊乱、贫血、体质量下降等全身症状[10]。UC病情常反复迁延不愈，其发病机制复杂，一直是学界的研究热点，临床上研究较多的机制包括遗传因素、感染因素、环境因素、饮食结构因素、免疫因素等，近年来氧化应激对UC发病的影响也逐渐受到关注[11]。氧化应激是体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态。正常情况下机体内的氧化过程与抗氧化过程处在动态平衡的状态，一旦这种平衡受到破坏，受氧化应激作用的刺激或损伤,体内ROS分泌会明显增多，而过量的ROS会造成机体细胞功能紊乱和损伤，诱发炎性反应[12]。MDA是自由基作用于脂质发生过氧化反应的氧化终产物，作为过氧化反应的代谢产物之一，其可以反映过氧化程度，也可以间接反映细胞损伤的程度[13]。MPO是一种由中性粒细胞表达并分泌的过氧化物酶，具有强效的促炎作用，并且可能直接参与组织损伤[14]。GSH是含有巯基的三肽化合物，在人体内具有活化氧化还原系统的生理活性，是体内一种重要的抗氧化剂，其通过巯基与自由基结合，直接使自由基还原成酸性物质，从而加速自由基的排泄，并对抗自由基对组织细胞的损害[15]。T-AOC是指体内各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成的总抗氧化水平，其水平越高表示机体抗氧化的能力越强[16]。Nrf2是机体抗氧化应激体系中的一类关键转录因子，同时也是维持细胞内氧化还原稳态的中枢调节者,其参与的Keap1-Nrf2信号通路被认为是机体参与抗氧化的最重要的通路之一[17]。正常情况下,存在于细胞浆中的Nrf2与胞质接头蛋白Keap1紧密结合，从而处于相对静止状态，但在机体受到氧化应激的作用下,Nrf2会迅速与Keap1分离后活化进入细胞核内,进而调控下游多种抗氧化酶如GSH等参与到清除氧化应激产生的有害物质的过程，Keap1-Nrf2信号通路介导的防御机制对正常细胞具有保护作用，在对抗多种疾病的病理状态中发挥着至关重要的作用[18]。本研究结果显示，模型组小鼠造模后饮食、饮水逐渐减少，毛发杂乱，精神状态差，出现血便，体质量下降，结肠组织病理观察也显示结肠黏膜缺损，腺体结构分离，大量中性粒细胞浸润，出现炎性反应，可见肉芽组织增生及纤维化，DIA评分及CMDI评分较空白组均明显升高(P<0.05)，说明UC模型造模非常成功；氧化应激指标中ROS、MPO和MDA水平较空白组明显升高(P<0.05)，T-AOC水平明显降低(P<0.05)，且结肠组织Keap1和Nrf2蛋白平均光密度值明显升高(P<0.05)，说明机体处于氧化应激过度的状态。

UC属于中医学脏毒、泄泻、肠风、痢疾等范畴，认为本病多由于外感湿热，或饮食内伤，或劳倦过度，导致脾胃受损，运化失司，水湿内聚，日久生热，湿热蕴结，下注大肠，湿热浸淫，气滞血瘀，损伤肠络，导致血败肉腐，发为溃疡[19]。大黄牡丹汤是治疗肠痈初起，湿热瘀滞的经典名方，方中大黄逐瘀泻下，解毒攻积；牡丹皮清热凉血，活血散瘀；桃仁性善破血，活血逐瘀；冬瓜仁清热利湿，排脓消痈；芒硝涤荡实热，软坚散结，使壅滞邪热自肠而出。全方集泻下、清热、利湿、逐瘀于一体，诸药合用，湿热得清，血滞得散，肠腑得通，则痈消痛止。现代药理学研究表明，大黄牡丹汤可通过抑制外周血中性粒细胞增殖、提高红细胞数和血红蛋白含量、提高免疫功能等发挥对UC的治疗作用[6，20]。柳氮磺胺吡啶属于氨基水杨酸类药物，是目前临床上治疗UC的一线用药，可通过消除氧自由基、抑制炎性反应等途径起到治疗作用[21]。本研究结果显示，与模型组比较，西药组予柳氮磺胺吡啶肠溶片灌胃干预后ROS、MPO、MDA及T-AOC水平均明显改善(P<0.05)，Keap1蛋白平均光密度值明显降低(P<0.05)；中药组予大黄牡丹汤灌胃干预后ROS、MDA、T-AOC及GSH水平均明显改善(P<0.05)，Keap1蛋白平均光密度值明显降低(P<0.05)；中西药组予联合干预后ROS、MPO、MDA、T-AOC及GSH水平均有明显改善(P<0.05)，Keap1蛋白平均光密度值明显降低(P<0.05)，且中西药组对ROS、MDA、T-AOC水平及Keap1蛋白平均光密度值改善程度均优于西药组和中药组(P<0.05)，对GXH及Nrf2改善优于西药组(P<0.05)，对MPO改善优于中药组(P<0.05)。说明柳氮磺胺吡啶肠溶片和大黄牡丹汤对UC模型小鼠均有抗氧化作用，且两者联合应用具有协同效应，可进一步提高疗效。

总之，氧化应激损伤是UC发病的重要机制，临床主要表现为持续性松散血便，结肠组织病理可见黏膜损伤，炎症细胞浸润，肉芽组织增生及纤维化，病变深度集中在肌层及浆膜层。大黄牡丹汤和柳氮磺胺吡啶肠溶片对UC均有确切的治疗作用，可改善小鼠的临床症状及结肠黏膜损伤程度，且两者联合应用具有协同效应，作用机制可能与调节Keap1-Nrf2信号通路，启动机体氧化应激调节程序，提高机体抗氧化能力有关。