动脉旁路移植术后静脉桥再狭窄通路的机制

张 浒 ，彭安睿 ，钟佳冀 ，黄 波

（1）昆明医科大学第一附属医院心脏大血管外科；2）麻醉手术科，云南 昆明 650032）

冠状动脉旁路移植术是治疗冠心病的重要手段，但静脉桥再狭窄严重影响了该手术的预后，目前临床针对桥血管再狭窄主要采用“双抗血小板治疗”，但静脉桥再狭窄的风险依然很高[1]，一项随机临床试验显示CABG术后3个月，只服用阿司匹林抗血小板治疗的患者有14.3%的静脉桥闭塞，服用阿司匹林加氯吡格雷“双抗血小板治疗”的患者依然有8.4%的静脉桥闭塞[2]。因此，研究静脉桥再狭窄的通路机制对于寻找新的药物治疗靶点具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

采用昆明医科大学动物实验中心提供的家兔40只，体重2.5～3.4 kg，雌雄不限。所选择的动物均符合云南省实验动物质量合格标准。实验动物饲养在昆明医科大学动物实验中心。

1.2 主要试剂和仪器

p-p38 抗体试剂盒，购自 GeneTex公司；SP-9001 生物素标记山羊抗兔 IgG 免疫组化检测试剂盒。自动真空组织脱水机（ASP200S，Leica，德国）；台式高速离心机（18 R，Dynamica Velocity，德国）；显微镜（Olympus，BX43，日本）；分析图像软件Image-Pro Plus 6.0（Media Cybemetics，美国）；酶标仪（iMark，Bio-Rad，美国）。

1.3 实验分组

40只家兔随机分成2组（n=20）。假手术组：动物麻醉，切开颈部皮肤，分离颈静脉、颈动脉，不做移植，关闭切口。实验组：按1.4方法建立冠状动脉旁路移植术兔模型。

1.4 冠状动脉旁路移植术兔模型制作

将家兔用 3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）耳缘静脉给药麻醉，并予术中维持静点。术前静点青霉素钠注射液40万U预防感染。麻醉后，家兔仰卧位，固定于动物手术台，常规颈部脱毛，碘伏消毒，无菌单铺单，颈部正中切口，长约8 cm，分离胸骨舌骨肌和胸骨甲状肌之间的组织，沿两条肌肉之间可找到颈总动脉，钝性离分颈总动脉，长度约3.5 cm，在颈部皮肤下，胸骨乳突肌的外缘，可见颈外静脉，游离，上至上颌内静脉分叉处，下至胸骨水平。肝素钠1 mg/kg 耳缘静脉注射，全身部分性肝素化，将静脉两端分别结扎，并取下长约3 cm静脉，上下两端用线标记。在动脉近端，远端分别放置无创血管夹，在颈动脉血管两处分别切取长约3 mm左右的纵行切口，用8-0prolene无创缝线顺时针连续缝合，静动脉形端侧吻合，每个吻合口处缝合约8～10针。吻合后排气打结，放开无创血管夹恢复血流，然后用0号棉线将动脉两吻合口中部血管结扎，动脉血流全部自静脉血管经过，充分止血，分层缝合。术后肌注青霉素钠预防感染，共3 d。动物置于清洁，通风，温度适宜环境中，

1.5 桥血管取材

术后第2天2组随机取10只兔子，剩余的10只兔子饲养到术后第2周。同法麻醉，实验组沿原有切口分离出桥血管，切断桥血管远端吻合口动脉端，可见有血液喷出，证实桥血管通畅，对桥血管中央部位进行活体取材。假手术组按沿原有切口分离颈静脉，取一段颈静脉。按实验方法不同要求分别固定并送检。

1.6 管腔狭窄程度测定

静脉桥组织切片，常规HE染色，应用 Image-Pro Plus 6.0 生物医学图像分析系统测量血管管腔增生程度，以 L1 表示管腔增生厚度，L2 表示管腔厚度，以 L1/L2 比值评估管腔狭窄程度，单位为百万像素。

1.7 p-p38免疫组化染色

常规组织切片，二甲苯脱蜡，10 min×2次，然后依次放置在无水乙醇 I、II、95%、80% 酒精中各 5 min。放置在H2O2室温中20 min。PBS冲洗3次，放于枸橼酸钠高压锅热修复，取出冷却，PBS洗冲3次。滴加一抗 p-p38（1∶100）在湿盒中，4 ℃一夜，复温到37 ℃1 h；PBS洗3次后，再加二抗，室温放置30 min；PBS洗3次。滴加链霉亲和素-过氧化物酶，37 ℃下孵育20 min；PBS洗3次，滴加DAB显色剂；自来水冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化、脱水，透明中性树胶封片。酶标仪上检测其吸光密度值（optical density value，OD值），每组中选取8张切片，显微镜观察，在高倍视野下（10×20倍）每张切片选取6个视野，采用 Imagine-Pro-Plus6.0图像分析系统进行图像采集和定量分析，计算出所选区域内平均吸光度（平均吸光度=累积吸光度÷有效区域面积），并取平均值[3]。

1.8 统计学处理

采用SPSS13.0软件进行统计学分析，所有计量资料服从正态分布，采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，假设不同水平下，各总体均值无显著差异，进一步两两比较LSD最小显著性差异法。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 桥血管肉眼观察

模型组桥血管在术后2 d和2周均有不同程度的管腔扩张，管壁增厚、水肿，管腔狭窄。模型组2周后内膜、中膜增厚最为显著，部分血管可见管腔次全闭塞，坏死物沉积（图1）。其中，与模型组比较，假手术组增生情况最轻，管腔通畅情况良好（图2）。

图1 模型组2周后桥血管Fig.1 Vein graft in model group（2 weeks）

图2 假手术组2周后桥血管Fig.2 Vein graft in sham operation group（2 weeks）

2.2 HE染色

HE染色后，观察到各组内膜、中膜均有不同程度的增厚。通过计算机图像软件分析，移植后2 d，模型组与假手术组比较，管腔狭窄程度差异无统计学意义（P＞0.05）；移植后2周，模型组与假手术组比较，管腔狭窄程度模型组大于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 管腔狭窄程度比较（）Tab.1 Comparison of the stenosis of lumen（）

表1 管腔狭窄程度比较（）Tab.1 Comparison of the stenosis of lumen（）

与假手术组比较，*P＜0.05。

2.3 各组静脉桥或颈静脉细胞磷酸化 p38（p-p38）免疫组化染色

在显微镜下观察静脉桥中 p-p38 蛋白表达，呈现粉红色者为阳性表达（图3箭头所示），无着色则为阴性表达。研究结果显示，p-p38 蛋白在黏膜层、黏膜下层、肌层均有不同程度的表达。与假手术组相比，模型组静脉桥组织内 p-p38 蛋白表达 OD 值显著升高（P＜0.05），模型组静脉桥组织内 p-p38 蛋白表达 OD 值在移植后2 d高于移植后2周，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图3 各组兔静脉组织中 p-p38MAPK 表达（×20）Fig.3 p-p38 MAPK expression in vein tissues of the rabbits in each group（× 20）

图4 各组兔静脉组织中p-p38 MAPK表达OD值Fig.4 OD value of p-p38 MAPK expression in vein tissues of the rabbits in each group

3 讨论

冠心病可引起心绞痛、心梗和缺血性心衰，是全球首位死亡原因[4]。通过移植自体血管恢复冠心病患者心肌灌注（再血管化）的冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass graft，CABG）是临床上治疗冠心病广泛应用的治疗手段，特别对于复杂的多支病变的冠心病患者[5-6]。大隐静脉由于长度长、解剖位置表浅等优点成为80%的 CABG再血管化中选用的桥血管[7]。但静脉桥再狭窄导致患者心绞痛再次出现而需要二次手术，从而严重制约了 CABG 的疗效[8]。CABG 术后1 a，大约10%的静脉桥完全闭塞，术后2～6 a里，每年新增1～2%的静脉桥闭塞，术后7～10 a，每年新增静脉桥闭塞率增至4%，手术10 a后接近 50%的静脉桥闭塞[9-10]。因此研究静脉桥再狭窄通路机制对未来发现静脉桥再狭窄药物治疗的靶点具有重要的意义。

静脉桥再狭窄，主要因为静脉移植到动脉环境后发生“动脉”粥样硬化。正常静脉不会发生粥样硬化，但移植静脉血流力学环境改变后，移植静脉为了适应新环境发生“动脉化”，血管平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）的增殖、迁移引起内膜增厚是后期发生粥样硬化的细胞学基础[11]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）最早在细胞有丝分裂中被发现，是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，故而得名，该激酶磷酸化是其活化状态。与动脉SMC相比，静脉SMC显示出增强的 MAPK 依赖性增殖[12]。p38-MAPK 通路是 MAPK 经典通路之一，与了细胞的增殖、凋亡、炎症反应、迁移、侵袭、形变以及干细胞分化等过程，各种刺激，例如炎性细胞因子、生长因子或外在作用力，都可以激活 p38-MAPK通路[13]。静脉桥再狭窄涉及的分子机制复杂，有待进一步阐明，已有研究结果提示 p38-MAPK 通路参与其中，Ge 等[14]发现p38 MAPK抑制剂 CBS3830 限制了动脉化静脉移植物的血管重塑。

为此，笔者进行了实验研究，将兔静脉移植到颈动脉建立CABG兔模型，2 d、2周后取出静脉桥，移植2 d后静脉桥管径没有再狭窄，移植2周后，静脉桥管径出现再狭窄，免疫组化染色结果显示模型组移植静脉 p-p38 高于假手术组未移植的颈静脉，提示 p38-MAPK 通路参与了静脉桥再狭窄过程的生物信号传导。静脉移植2 d静脉组织中 p-p38 高于移植2周，提示 p-p38 在移植早期明显升高，然后逐渐回落。对CABG静脉桥再狭窄发生、发展过程中细胞内信号通路的研究将为最终解决移植静脉桥再狭窄这一临床难题提供早期干预的靶点，当然这不可能一蹴而就，还需要更多、更深入的研究。参