肺纤方对小鼠肺纤维化模型及NIH3T3成纤维细胞作用机制的研究

谢 纬 唐明文 郭竹英 陈 生 黄俊浩 曾梓苑

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种病因不明、慢性进行性纤维化性间质性肺炎，病变局限于肺脏，其肺组织学及胸部高分辨CT表现为以普通型间质性肺炎(UIP)为特征的一种慢性间质性肺疾病，主要表现为弥漫性肺泡炎、肺泡单位结构紊乱和肺纤维化[1]。在各种形式的间质性肺病中，IPF作为最常见的特发性间质性肺炎，IPF因其独特的不良预后和对传统疗法无反应性而受到较多关注[2]。至今导致IPF发生的病因和发病机制尚不明确，对于IPF 目前尚无肯定显著有效的治疗药物，目前治疗药物主要有糖皮质激素、吡非尼酮、尼达尼布和N-乙酰半胱氨酸等，但疗效仍不理想，且部分药物不良反应大。肺移植可以延长具有适应症IPF患者的生存期，改善其生活质量，提高其生存率，但技术要求高，供体稀缺，费用昂贵，限制了肺移植在临床上的实施[1]。中医药治疗IPF有其独特的优势并展现出广阔的应用前景。目前已经有不少关于中医药治疗肺纤维化的实验和临床研究[3]，但关于中药对成纤维细胞的影响未见相关报道。本研究通过前期探索应用博来霉素建立肺纤维化小鼠模型结果的基础上[4]，以博来霉素(8 mg/kg)建立肺纤维化小鼠模型，观察中药肺纤方干预后对小鼠肺泡炎和肺纤维化程度的影响，同时拟通过体外细胞培养的方法来探讨不同浓度的肺纤方煎剂对细胞增殖的影响以及是否存在抑制成纤维细胞CyclinDl表达和改善MMPs/TIMPs系统失衡等可能，进一步探讨其可能存在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级雄性KM小鼠，体重20～22 g，由南方医科大学实验动物中心提供；小鼠NIH3T3细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；肺纤方煎剂(桃仁10 g、红花10 g、当归10 g、生地黄10 g、牛膝10 g、川芎10 g、桔梗10 g、赤芍10 g、枳壳10 g、柴胡10 g、黄芪30 g、党参15 g、法半夏10 g、化橘红10 g、茯苓10 g、石菖蒲10 g、胆南星10 g、天竺黄10 g、甘草10 g组成，由深圳市中医院提供)，本院制备，剂型为浓缩袋装煎液(为成人剂量150 毫升/袋，按1 g/mL剂量，每天2次，每次1袋，按成人60 kg体质量计算，给药量相当于5 g/kg，中剂量组为原液再次浓煎成一半剂量制备，以此法再次浓缩制备高剂量中药液)；注射用盐酸博莱霉素(上海生工；A606211)；甲泼尼龙(主要成分甲泼尼龙琥珀酸钠；Pfizer Manufacturing Belgium NV；注册证号H20170197)；羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)测定试剂盒；兔抗小鼠CyclinD1多克隆抗体(ab16663)；兔抗小鼠MMP2多克隆抗体(ab97779)；兔抗小鼠TIMP1多克隆抗体(ab38978)；以上抗体购自abcam 公司。

1.2 模型制备及分组

雄性KM小鼠60只，正常饲养1周后，其中取出50只小鼠，随机分为模型组、甲泼尼龙组、肺纤方低、中、高剂量组，每组10只，使用腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后固定于操作台，以动物喉镜压下小鼠舌根暴露声门，将雾化器(针头灌胃器)从声门插入气管喷入博来霉素溶液(8 mg/kg)，间隔10 d后第二次给同等剂量博莱霉素造模，第二次给药14 d(第一次给药后24 d)后成模[3]；成模后第二天(即第一次给药第25天)将造模动物随机分为5组：模型组、甲泼尼龙组、肺纤方低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组各10只。空白对照组10只小鼠用相同的方法气管内雾化等容生理盐水，25 d后给予开始每天给予相同体积(和低剂量中药煎剂等同)生理盐水灌胃14 d；肺纤方低、中、高剂量组每日分别给予肺纤方高、中、低剂量(20、10、5 g/kg)q12h灌胃；模型组给予相同体积生理盐水(和低剂量中药煎剂等同)灌胃,qd；甲泼尼龙组给予甲泼尼龙1 mg/kg溶于相同体积生理盐水(和低剂量中药煎剂等同)灌胃,qd；治疗14 d后上述各组小鼠于第38天后处死，留取肺脏标本。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 肺组织染色及肺泡炎及纤维化评价方法 常规肺病理组织标本固定、脱水、透明、包埋、切片，分别进行HE及Masson染色，镜下观察HE及Masson染色结果并照相。根据肺泡炎评价方法[5]：3级:重度改变，病变范围占全肺的50%以上，计3分；2级：中度改变，病变范围占全肺的 20%～50%，计2分；1 级：轻度改变，病变范围小于全肺的20%，计1分；0级：无明显病理改变，肺泡结构正常，肺泡透亮，计0分。根据纤维化程度评价方法[6]，纤维化程度：8级：完全纤维化，计8分；7级：肺泡腔充斥纤维组织，出现肺大疱，计7分；6级：纤维灶面积大于50%，计6分；5级：纤维灶面积大于10%～50%，计5分；4级：纤维灶面积小于10%，计4分；3 级：连续纤维区域，计3分；2级：明显纤维化出现，计2分；1级：肺泡轻微肿胀，局部轻微纤维出现，计1分；0级：正常肺，计0分。

1.3.2 小鼠肺组织羟脯氨酸(Hyp)测定 将小鼠处死后剖开取右肺中叶组织，使用4 ℃生理盐水进行冲洗，滤纸吸湿后，称取0.3 g，采用微量电动组织匀浆器研磨，如光镜下未见完整细胞后即可将其制成10%的肺组织匀浆。4 ℃环境下6 000 r/min离心5 min，提取上清液并置于-20 ℃条件下保存，用比色法测定Hyp含量。

1.3.3 小鼠NIH3T3成纤维细胞培养 通过将含10%的胎牛血清的DMEM培养液在湿饱和的培养箱中培养。待细胞生长到90%时用胰蛋白酶消化，取对数生长期的细胞种于孔板中，待细胞贴壁后，分别进行不同处理。分为对照组、肺纤方低浓度剂量组、肺纤方中浓度剂量组、肺纤方高浓度剂量组，分别给予肺纤方煎剂低浓度剂量(终浓度5 μg/mL)、中浓度剂量(终浓度10 μg/mL)、高浓度剂量(终浓度20 μg/mL)，对照组在同样条件下给予相同体积的生理盐水进行干预，一定时间点后进行相关检测。

1.3.4 MTS法检测肺纤方对细胞存活力的影响 将处于对数生长期的NIH3T3细胞用胰蛋白酶消化，消化后对细胞进行计数，调整细胞浓度以2×104接种于96孔板中，舍弃周边孔。待细胞贴壁后，吸出培养基，分别换为含有低、中、高浓度的肺纤方的培养基和基础培养基。每组设3个复孔。分别在4、24、48、72 h每孔中加入10 μL的MTS检测溶液。37 ℃孵育3 h，用酶标仪于490 nm波长检测吸光度值(A)。R细胞存活=A加药细胞/A对照细胞。

1.3.5 平板克隆形成实验 接种对数期细胞到10 cm培养皿，每个皿接种1×104个细胞。接种完后十字晃动使细胞均匀分散，放入细胞培养箱进行培养1～2周，期间观察细胞生长情况，以免生长过度。单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆或集落。染色：预冷的PBS洗涤两次；甲醇固定15 min，弃去固定液；Giemsa 染色10 min；自来水冲洗，空气干燥后计数。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.3.6 Western blot法测定细胞CyclinD1、MMP2、TIMP1蛋白的表达水平 培养对数生长期的NIH3T3细胞系于6孔板中，经不同浓度的肺纤方煎剂干预48 h后，用细胞组织裂解液RIPA提取细胞总蛋白，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF滤膜，5%脱脂奶粉封闭，加入CyclinD1、MMP2、TIMP1和GAPDH抗体，4 ℃过夜孵育；第二天洗涤后加入HRP标记的二抗，孵育1 h；用滤纸拭去膜上过多的液体，加上发光底物均匀覆盖在PVDF膜上，避光反应3～5 min。Bio-Rad化学发光成像系统取像，用Scion Image软件对蛋白条带进行光密度分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0版统计软件分析，计量数据中符合正态分布的资料以均数±标准差表示，通过单因素方法分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺病理组织学观察

2.1.1 肺组织肺泡炎及肺纤维化评分比较 与对照组比较，模型组肺泡炎及肺纤维化评分显著升高(P<0.05)；与模型组比较，甲泼尼龙组和肺纤方各剂量组肺泡炎及肺纤维化评分降低(P<0.05)，且随着肺纤方剂量的升高，肺纤方各剂量组肺泡炎及肺纤维化评分逐渐降低，呈剂量依赖性(P<0.05)；与甲泼尼龙组比较，肺纤方低、中剂量组肺泡炎及肺纤维化评分升高(P<0.05)，肺纤方高剂量组肺泡炎及肺纤维化评分差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 各组小鼠肺泡炎及肺纤维化评分比较

2.1.2 HE染色 ①A1对照组:肺组织结构正常。②A2对照组:肺泡间隔明显增厚,大量炎性细胞浸润,重度纤维组织增生,可见大量成纤维细胞聚集,病变区肺泡结构破坏紊乱,肺泡间隔变薄或断裂。③A3甲泼尼龙组:肺泡间隔略增厚,少量纤维组织增生及炎性细胞浸润,肺泡结构基本正常。④A4肺纤方低剂量组:肺泡间隔明显增厚,纤维组织增生明显,可见较多炎性细胞浸润及成纤维细胞聚集,部分肺泡结构破坏,肺泡间隔变薄或断裂。⑤A5肺纤方中剂量组:肺泡间隔轻-中度增厚,轻到中度度纤维组织增生,可见少量炎性细胞浸润,部分肺泡结构破坏，较低剂量组减轻。⑥A6肺纤方高剂量组:肺泡间隔轻微增厚,少量纤维组织增生及炎性细胞浸润,肺组织形态接近正常(见图1)。

2.1.3 Masson染色 ①B1对照组:除支气管及血管壁偶有胶原沉积外,肺泡间隔无明显胶原纤维增生。②B2对照组:肺泡间隔中可见大量胶原纤维增生。③B3甲泼尼龙组:肺泡间隔中可见少量胶原纤维增生。④B4肺纤方低剂量组:肺泡间隔中可见中等量-大量胶原纤维增生。⑤B5肺纤方中剂量组:肺泡间隔中可见少量-中等量胶原纤维增生。⑥B6肺纤方高剂量组:肺泡间隔中可见少量胶原纤维增生(见图2)。

2.2 肺组织羟脯氨酸(Hyp)含量

实验结果显示，随着肺纤方剂量的增加，小鼠Hyp含量随之降低，但高剂量组Hyp仍明显高于对照组(P<0.05)，低剂量组Hyp含量明显低于模型组(P<0.05)(见表2)。

表2 各组肺组织Hyp含量比较

2.3 对NIH3T3细胞的存活率影响

MTS检测实验结果显示：药物干预4 h时，肺纤方各剂量组细胞存活率与对照组相比，差异无显著统计学意义；干预24 h及以上，肺纤方各剂量组与对照组相比，能明显抑制细胞的存活率，且随时间延长(72 h)，差异有显著统计学意义(P<0.05)；但肺纤方不同浓度的抑制作用差异不明显。实验结果表明肺纤方具有抑制NIH3T3细胞的增殖能力，且呈时间依赖，但无浓度依赖性(见表3及图3)。

图3 MTS法检测肺纤方对细胞存活率的影响

2.4 平板克隆形成实验

NIH3T3成纤维细胞经1周培养形成类圆形细胞集落，后逐渐增大。培养2周结果：与对照组(C1)相比，肺纤方低剂量组(C2)、中剂量组(C3)、高剂量组(C4)NIH3T3成纤维细胞克隆数均明显降低(P<0.05)，但随着肺纤方浓度剂量增加，细胞克隆数略有增加，证实肺纤方可抑制NIH3T3成纤维细胞的增殖能力，但各药物浓度剂量组比较差异不明显(P>0.05)(见图4)。

图4 平板克隆形成实验结果

2.5 Western blot法测定细胞CyclinD1、MMP2、TIMP1蛋白的表达水平的影响

与正常对照组相比，肺纤方各组对CyclinD1和MMP2蛋白的表达均有下调，且一定范围内随药物浓度增加，CyclinD1蛋白表达下调越明显；同时肺纤方各组TIMP1蛋白的表达有所增加，但是差异不显著；而肺纤方各组GAPDH条带灰度比值无明显差异(见图5)。

图5 Western blot法测定细胞CyclinD1、MMP2、TIMP1蛋白的表达水平的影响

3 讨论

IPF是一种病因不明、以UIP为特征的一种慢性间质性肺疾病,IPF患者从诊断开始中位生存期仅 2～3 年[1]。在目前尚缺乏有效治疗药物情况下，中医药在改善患者症状、提高患者生活质量、减轻患者病情等方面取得一定的疗效，并开展了大量的实验研究[3]。笔者2014年入选广东省首批名中医师承项目学术继承人，跟师“龙江医派”学术传承人曲敬来教授，通过长期跟师学习，总结曲教授对肺纤维化临床经验，认为肺纤维化中医属“肺痹、肺痿”范畴，其基本病机为“气虚痰结络瘀”，为本虚标实、虚实夹杂之证，临床突出“虚、痰、瘀”等病理特点[7]。治疗上强调益气涤痰逐瘀为基本大法，结合“怪病多痰”、“百病多由痰作祟”、“久病从痰论治”、“胸中血府血瘀之证”的观点，以血府逐瘀汤合涤痰汤、补中益气汤组成肺纤方主方，进行辨证论治，取得一定疗效。

肺纤维化是多种肺部疾病的共同结局，其特征是的成纤维细胞增殖活化和细胞外基质(ECM)过度沉积，导致正常肺泡结构破坏[8-10]。成纤维细胞作为细胞外基质(ECM)合成及分泌基质金属蛋白酶(MMPs)、基金蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)的主要细胞，其活化、增殖以及通过释放介质及产生细胞外基质(ECM)在肺纤维化发病机制中起决定性作用[11]。基质金属蛋白酶(MMPs)具有促进细胞外基质降解的作用，而TIMPs可抑制MMPs活性。研究表明, MMPs与TIMPs的过度高表达以及 MMPs/TIMPs的比例失衡是纤维化发生及发展的关键[12], 其中以 MMP2/TIMP1为代表。生理情况下，肺内胶原蛋白的合成和降解处于平衡状态。肺纤维化过程中，成纤维细胞能够分泌MMPs，MMPs/TIMPs比例升高，其中MMP2/MMP9可降解肺泡壁ECM和基底膜中的蛋白，使更多的成纤维细胞、炎症细胞移行侵入肺间质并增殖，分泌更多的MMPs，MMPs可以促进异常上皮细胞的迁移和其他异常的修复过程，而且可以增加肺水平或促纤维化介质活动或减少肺抗纤维化介质水平，加重纤维化[13-14]。

在细胞增殖周期中，有两个关键性限制点(G1/S期和G2/M期限制点)，CyclinD1作为G1期中两个关键调节蛋白之一[15]，在细胞周期进程中起重要的正性调节作用，CyclniD1表达增加可推动细胞周期跨越R点，由S期向G1期转换，推动细胞的有丝分裂，促进细胞增殖[16]。有研究指出IPF患者体内RhoA介导的成纤维细胞CyclinD1表达增加，进而导致成纤维细胞数目的增殖[17]。因此，通过针对抑制成纤维细胞病态增殖的研究对于IPF的治疗有一定的研究价值。

本研究应用前期造博莱霉素二次造模建立稳定肺纤维化小鼠模型，给予不同剂量肺纤方煎剂干预，对肺组织切片进行肺泡炎及肺纤维化评分，并测定肺组织羟脯氨酸含量，评价肺纤方对小鼠模型肺泡炎及纤维化的影响。研究结果显示：采用肺纤方干预的小鼠评分和羟脯氨酸含量均明显低于模型组(P<0.05)，且上述指标值随着肺纤方剂量的增加而降低，HE染色和Masson染色结果亦显示采用肺纤方干预小鼠肺组织肺泡炎和纤维化程度均有明显改善，但与强的松组无显著统计学差异，结果提示肺纤方对于抑制小鼠肺纤维化程度有一定作用，且具有一定的浓度依赖性。同时本研究对小鼠NIH3T3成纤维细胞培养并进行平板克隆形成实验和Western blot测定细胞蛋白的表达水平，结果显示，肺纤方可明显抑制NIH3T3成纤维细胞增殖，对CyclinD1和MMP2蛋白的表达均有下调，且一定范围内随药物浓度增加，CyclinD1蛋白表达下调越明显；同时提高TIMP1蛋白的表达，但是各组差异不显著；而肺纤方各组GAPDH条带灰度比值无明显差异。结合上述实验研究结果表明，肺纤方能有效抑制NIH3T3细胞的增殖，对于抑制CyclinD1蛋白的表达和MMP2/TIMP1产生一定逆调节作用，一定程度反向调节MMP2/TIMP1比率，促进失衡MMPs/TIMPs比例的恢复。进一步说明肺纤方可能参与矫正MMPs/TIMPs比例，并阻断成纤维细胞持续迁移激活状态的作用机制。

综上所述，中药复方肺纤方能够有效抑制博来霉素致小鼠肺泡炎和肺纤维化，降低其纤维化程度；同时可抑制NIH3T3细胞的增殖和矫正失衡MMPs/TIMPs比例，提示肺纤方可能通过抑制成纤维细胞持续迁移激活状态，从而改善肺纤维化，为进一步研究中药复方治疗肺纤维化的作用机制提供理论和实验依据。