右美托咪定抑制缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞Parthanatos死亡

谷 宇 尧永华 陆殿宇

急性肾损伤(Acute kidney injury, AKI)是一种常见的临床并发症，以肾小球滤过率突然下降为主要特征。近年来尽管肾脏替代疗法等支持治疗取得了较大进步，AKI 发生5年后死亡率仍高达50%[1]。肾缺血再灌注损伤(Renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是引发AKI的主要原因，可见于许多临床情况下，如肾移植、部分肾切除、心脏手术、败血症等[2]。既往多项研究指出，RIRI过程中肾小管上皮细胞主要发生凋亡和坏死，然而采取相应的干预性治疗措施并不能有效降低患者的发病率及死亡率[3]。因此，深入探讨RIRI的致病机制，寻找有效的防治方法仍是临床亟待解决的难题。

新近研究发现DNA损伤参与多种疾病的细胞损伤和死亡过程，尤其在缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury, IRI)相关的细胞死亡中起重要作用[4-5]。轻度细胞DNA损伤可以通过活化多聚ADP 核糖聚合酶-1(PolyADP-ribose polymerase-1, PARP-1)完全修复；较严重DNA损伤会引发细胞凋亡；而广泛严重的DNA损伤会引发一种独特的细胞死亡形式——PARP-1依赖性细胞死亡(Parthanatos)。最近有研究提示Parthanatos可能是IRI细胞死亡的重要形式。本研究旨在探讨Parthanatos与RIRI病理过程之间的关系，为进一步寻找有效药物干预Parthanatos死亡并防治AKI打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

正常人肾小管上皮细胞HK-2(中国典型培养物保藏中心)；胎牛血清，胰蛋白酶(Gibco)；右美托咪定(Dexmedetomidine, Dex, 江苏恒瑞)；CCK-8检测试剂盒(Dojindo)；LDH试剂盒(Roche)；活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂(Sigma-Aldrich)；Trizol试剂(Invitrogen)；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和SYBR® Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及H/R处理 我们采用人肾小管上皮细胞缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation, H/R)模型模拟RIRI。细胞培养箱(温度37 ℃, 湿度90%, 95%空气+5%CO2)内细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。HK-2细胞培养至融合约80%，进行H/R处理，细胞更换为无糖无血清培养基，放入湿润的缺氧培养箱(Galaxy 48R; Eppendorf, Hamburg, 德国)进行低氧(95% N2+5% CO2)处理24 h，随后取出放入常氧环境进行复氧处理4 h，即缺氧24 h复氧4 h(H/R)处理。

1.2.2 实验分组及药物处理 细胞用随机数字表分为4组：对照组(Control)组、Dex组、H/R组、Dex+H/R组，每组n=5。Dex组和Dex+H/R组预先用含1 nmol/L右美托咪定的培养基处理1 h，随后Dex组更换为普通培养基放回常氧培养箱继续培养，Dex+H/R组则更换为无糖无血清培养基放入低氧培养箱进行H/R处理。

1.2.3 细胞活力和LDH释放检测 将HK-2细胞接种于96孔板，细胞密度约5 000个/孔。不同处理完成后，应用细胞计数(Cell Counting Kit-8, CCK-8)试剂盒和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)试剂盒，按照试剂盒说明书进行具体操作，使用酶标仪检测检测细胞活力以及LDH释放情况。

1.2.4 检测细胞内ROS含量 细胞接种于24孔板，各组处理完毕后，应用2,7-二氯荧光素二乙酸脂(2,7-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)检测细胞内ROS水平。

1.2.5 实时定量PCR(qRCR) 应用Trizol试剂(Invitrogen)提取细胞中总RNA，NanoDrop-1000分光光度计检测RNA量和浓度，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO)进行逆转录，SYBR® Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)以及Roche LightCycler 1.1行qRCR定量分析PARP-1mRNA和凋亡诱导因子(apoptosis Inducing Factor, AIF)mRNA变化，使用GAPDH作为管家基因。

1.3 统计学处理

使用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量数据用均数±标准误表示，组间比较使用单因素方差分析，P<0.05表明差异有统计学意义。

表1 实验使用的引物序列

2 结果

2.1 Dex能明显减轻H/R处理导致的HK-2细胞损伤

与Control组相比，H/R处理能明显降低HK-2细胞的活力(P<0.05)，而应用1 nmol/L Dex预处理1 h后再行H/R处理，能明显提升HK-2细胞的活力(P<0.05)，Dex本身对HK-2细胞的活力无明显作用。见图1。

注：*与对照组比较有显著差异，P<0.05；#与H/R组比较有显著统计学差异，P<0.05

与Control组相比，H/R处理能明显增加细胞LDH的释放(P<0.05)，而应用1 nmol/L Dex预处理1 h后再行H/R处理，能明显降低HK-2细胞LDH的释放(P<0.05)，Dex本身对HK-2细胞LDH的释放无明显作用。见图2。

注：*与对照组比较有显著差异，P<0.05；#与H/R组比较有显著统计学差异，P<0.05

2.2 Dex能明显抑制H/R处理HK-2细胞内ROS含量的增多

与Control组相比，H/R处理能明显增加细胞内ROS的含量(P<0.05)，而应用1 nmol/L Dex预处理能明显抑制H/R处理HK-2细胞内ROS含量的增加(P<0.05)，Dex本身对HK-2细胞ROS的含量无明显作用。见图3。

注：*与对照组比较有显著差异，P<0.05；#与H/R组比较有显著统计学差异,P<0.05

2.3 Dex能明显抑制H/R处理HK-2细胞内PARP-1mRNA和AIF mRNA表达

与Control组相比，H/R处理能明显提升细胞内PARP-1 mRNA和AIF mRNA表达(P<0.05)，而应用1 nmol/L Dex预处理能明显抑制H/R处理HK-2细胞内PARP-1 mRNA和AIF mRNA表达(P<0.05)，Dex本身对HK-2细胞PARP-1 mRNA和AIF mRNA表达无明显作用。见图4。

注：*与对照组比较有显著差异，P<0.05；#与H/R组比较有显著统计学差异，P<0.05

3 讨论

AKI的病理学特征主要是肾小管上皮细胞损伤和死亡[6]。既往研究认为坏死和凋亡是AKI肾细胞最重要的死亡方式[7]。RIRI不同阶段细胞死亡的主要形式不同，短暂肾缺血导致细胞凋亡，而长期持续的肾缺血则造成细胞的坏死[8]。然而针对坏死和凋亡的干预治疗并未有效改善RIRI患者的预后。近年来研究发现，DNA损伤与多种疾病的细胞损伤和死亡相关，尤其在器官缺血性疾病中似乎扮演着重要的角色[4-5]。

DNA储存着生命体赖以生存和繁衍的遗传信息，其完整性的维系对个体生存和物种稳定起着至关重要的作用。然而，在生命进程中DNA难免会受到多种外源性(如紫外线辐射和电离辐射)以及内源性(如ROS)损伤因素的攻击，进而引起DNA损伤[9-11]。据报道，ROS诱导的氧化应激是引起细胞DNA损伤的重要因素[12]。我们的前期研究已经证实RIRI过程中会产生大量的ROS[13]。因此我们推测RIRI中发生的严重氧化应激可能造成肾细胞DNA损伤，甚至直接导致细胞死亡。PARP-1是一种能感应DNA损伤的核蛋白酶。PARP-1在细胞DNA氧化损伤中具有双向作用：促进DNA损伤修复与细胞存活以及诱导Parthanatos死亡。过多ROS诱导的氧化应激会造成持续的DNA损伤，导致PARP-1过度活化，消耗细胞内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和ATP，引起能量耗竭及线粒体功能障碍，最终引发AIF介导的Parthanatos死亡[14]。本研究建立与动物RIRI模型相对应的细胞H/R模型，排除了神经体液的影响，直接探讨其对细胞DNA损伤和细胞Parthanatos死亡的影响。研究发现，H/R能明显诱导细胞内ROS的过量产生，同时Parthanatos死亡关键基因PARP-1和AIF的表达明显也增高，这与细胞活力的降低以及LDH释放的增加具有明显的同步性。提示Parthanatos死亡可能与H/R导致的肾细胞活力下降以及细胞死亡关系密切。

Dex是一种高选择性的α2肾上腺素能受体(α2-AR)激动剂，具有镇静、镇痛、抗焦虑和抗交感神经的活性，广泛应用于临床麻醉及重症医学[15-17]。近年来，Dex在抑制氧化应激和全身炎症反应、降低细胞死亡等方面的作用受到越来越多的关注[18-22]。本研究发现，应用Dex能明显抑制H/R肾细胞内ROS含量的增加，同时还显著降低H/R肾细胞内PARP-1和AIF的表达，提示Dex可能通过减轻氧化应激，进而降低Parthanatos死亡的发生。这与Dex预处理可明显增加H/R肾细胞活力、降低肾细胞LDH释放的结果相吻合。

综上所述，我们认为肾细胞缺氧复氧过程中Parthanatos死亡可能具有重要作用，而Dex可能通过抑制ROS的产生降低Parthanatos死亡的发生。