Box-Behnken响应面法优化头孢丙烯干混悬剂处方*

肖颖，武美娟，郭远玲

(广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂药研所/ 广东省化学药原料与制剂关键技术研究企业重点实验室，广州 510515)

头孢丙烯是美国食品药品管理局(FDA)批准的第一个可用于治疗儿童中耳炎和鼻窦炎的口服头孢菌素类抗生素，国内外最多的剂型为片剂，颗粒剂和干混悬剂，在对头孢丙烯原料及各剂型的杂质研究过程中，笔者在头孢丙烯干混悬剂原研及自制制剂中杂质K附近发现了尚未见文献报道的特有杂质Z，且其含量在储存过程中会增加，通过LC-HR-MS/MS方法鉴定了其结构，并推测这一特有杂质Z的产生与该剂型中的助悬剂及酸度调节剂有关。

响应面法是目前科学研究中经常用到的一种工艺优化、实验条件优化方法[1-8]，它相对于正交试验法，可以连续地对实验的各个水平进行分析，所得结果更加合理、可靠。

本研究通过Box-Behnken 响应面法对头孢丙烯干混悬剂的处方进行优化，对辅料枸橼酸、枸橼酸钠和微晶纤维素-羧甲基纤维素钠的用量进行优化，控制处方中的特有杂质Z，从而保证产品质量及疗效。

1 仪器与试药

1.1仪器 FA-2004 型分析天平(感量：0.1 mg，上海天平仪器厂)；DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪(PDA检测器)；十八烷基硅烷键合硅胶柱(P250 mm×4.60 mm，5 μm)；超声波处理器；GF-300型电子天平(感量：1 mg，广州市艾安得仪器有限公司)；ACS-6型电子计量天平(广州市中兴电子衡器厂，感量：2 g)；HLSG-20A湿法混合颗粒机(北京航空制造工程研究所)；XL-250型旋转式颗粒机(常州市佳发制粒干燥设备有限公司)；PLB-3多功能制粒包衣机(重庆广厦干燥设备工程公司)；HLS-50实验室料斗混合机(浙江小伦制药机械有限公司)；SHH-250SD型药物稳定性试验箱(重庆市永生实验仪器厂)。

1.2试药 头孢丙烯(齐鲁安替制药有限公司，批号：8345HJ81TH，湿品含量：95.18%)，枸橼酸(湖南尔康制药股份有限公司，批号：100820190501)，枸橼酸钠(湖南尔康制药股份有限公司，批号：001220190515)，蔗糖(嘉兴市白浪淀粉制品有限公司，批号：20190331)，微晶纤维素-羧甲纤维素钠(FMC CORPORATION，批号：EN18832697)，甜橙粉末香精(佛山市三水百花香料香精科技有限公司，批号：20181002-A7)，磷酸二氢铵(分析纯)、磷酸(分析纯)、盐酸(分析纯)、乙腈(色谱纯)、头孢丙烯对照品(中国食品药品检定研究院，批号：130567-200902，标示含量：异构体 Z 85.9%、E 9.2%)，杂质A对照品(EP，批号：1.0)，杂质B对照品(中国食品药品检定研究院，批号：130431-201203)。

2 方法与结果

2.1头孢丙烯干混悬剂的制备工艺 称取制粒处方量的头孢丙烯原料，蔗糖、枸橼酸、枸橼酸钠、微晶纤维素-羧甲基纤维素钠等辅料，混合3 min，加入润湿剂，制软材，将制好的软材加入旋转式颗粒机制颗粒，湿颗粒放入多功能制粒包衣机中进行沸腾干燥，干颗粒加入甜橙粉末香精，混匀即得。

2.2最大未知单杂测定 参照《中华人民共和国药典》2015年版二部头孢丙烯颗粒标准，采用高效液相色谱法(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0512)测定特有杂质Z。

2.2.1色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Gemini C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-磷酸二氢铵水溶液(取磷酸二氢铵11.5 g，加水溶解，调节pH值至 4.4，用水稀释至 1 000 mL)(50：50)；流速：1 mL·min-1，柱温：40 ℃；检测波长：230 nm；进样量：10 μL。

2.2.2溶液的配制 ①供试品溶液的配制方法：精密称取头孢丙烯干混悬剂适量(相当于头孢丙烯125 mg)，置25 mL量瓶中，加103 g·L-1盐酸1 mL使其溶解，用流动相磷酸二氢铵水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过。

②对照溶液的配制方法：精密量取供试品溶液1.0 mL，置100 mL量瓶中，用流动相磷酸二氢铵水溶液稀释至刻度，摇匀。

③头孢丙烯杂质对照品溶液的配制方法：取头孢丙烯杂质A、杂质B对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每毫升中含杂质A 10 μg、杂质B 25 μg的溶液，摇匀。

2.2.3测定 精密量取对照溶液10 μL注入液相色谱仪；在系统适用性实验符合要求的条件下，调节检测灵敏度，使主成分峰高约为满量程；再精密量取对照溶液、供试品溶液与头孢丙烯杂质对照品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图(图1—图3)，保留时间约22 min为杂质Z。

图1 头孢丙烯干混悬剂有关物质色谱图

图2 对照溶液有关物质色谱图

图3 杂质A、B对照品色谱图

2.3Box-Behnke响应面积法优选头孢丙烯干混悬剂处方 以处方中枸橼酸、枸橼酸钠、微晶纤维素-羧甲基纤维素钠为因素，未知杂质Z(成品于温度60 ℃ 75%RH条件下放置5 d后测定)为考察指标，采用Box-BehnkeDesign方法优选其用量。

2.3.1试验设计 Box-Behnke试验设计因素水平见表1，试验设计及结果见表2。

表1 Box-Behnken 响应面试验设计因素及水平

表2 Box-Behnken 响应面试验设计和结果

2.3.2Box-Behnken响应面试验模型的建立以及显著性检验 采用ANOVA分析Box-Behnken 响应面的回归参数。运用Design-Expert 8.0版软件对试验数 据进行二次方程回归分析，得拟合方程为：Y=1.34-2.31A-0.82B+0.32C+0.14AB-0.22AC-0.010BC+1.73A2+1.53B2+1.60C2(R2=0.989 2)A代表枸橼酸的用量；B代表枸橼酸钠的用量；C代表微晶纤维素-羧甲基纤维素钠的用量；R2代表回归曲线方程的相关系数，式中Y代表杂质Z的含量；由表3可知效应面模型达到极显著水平，且模型中因素A和因素B对杂质Z的含量均有极显著影响，因素C也对杂质Z的含量有显著影响，模型的失拟项不显著，该模型具有统计学意义。

表3 方差的显著性检验及方差分析

2.3.33D响应面图及等高线图 应用 Design-Expert 8.0版软件，根据拟合方程，以杂质Z的千分含量为响应值，对各因素做3D响应面及等高线图(图4)。由图4可知，杂质Z的含量随处方中枸橼酸和枸橼酸钠用量的增加而降低，随微晶纤维素-羧甲基纤维素钠用量的增加而上升。

图4 杂质Z的3D 效应面图和等高线图

2.3.4处方优化及模型验证 运用Design-Expert 8.0版软件进行。处方预测，得到最优处方为：枸橼酸用量为16.89 mg；枸橼酸钠用量为27.67 mg；微晶纤维素-羧甲基纤维素钠用量为23.78 mg；响应值的预测值杂质Z的含量为1.09‰。

按照优化所得处方制备3批头孢丙烯干混悬剂，并于温度60度75%RH条件下放置5 d后测定其杂质Z的含量，相应变量的预测值和实测值见表4，结果表明，3批头孢丙烯干混悬剂杂质Z含量的实测值与预测值基本一致，表明该模型预测性良好，可信度高。

表4 处方预测值与实测值

3 讨论

笔者在研究中尚未发现在片剂和颗粒剂中存在这一杂质，但在头孢丙烯干混悬剂的开发研究中，在原研制剂及自制制剂中均发现了未知杂质Z，其位置在杂质K附近，且在高温高湿的条件下，杂质Z含量呈增长状态。通过LC-HR-MS/MS，鉴定了其结构，并推断其生成过程与干混悬剂中的助悬剂及酸度调节剂有关，本处方中枸橼酸和枸橼酸钠在处方中为酸度调节剂，微晶纤维素-羧甲基纤维素钠为助悬剂，本研究通过Box-Behnken响应面法优化处方中有可能影响到杂质Z的辅料枸橼酸、枸橼酸钠和微晶纤维素-羧甲基纤维素钠的用量，以保证杂质Z符合质量要求，从而保证产品质量及疗效。在处方中加入枸橼酸16.89 mg及枸橼酸钠27.67 mg作为pH缓冲剂，微晶纤维素-羧甲基纤维素钠23.78 mg作为混悬剂，可达到抑制杂质Z含量增长的目的，保证样品的稳定性，从而保证产品的质量及疗效。