circZBTB44通过调控AKT通路促进肾透明细胞癌增殖和迁移的研究

钟启宇，谢文练

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC），简称肾 癌，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其全球发病病例数约占成人恶性肿瘤新发病例数的4%，且发病率和死亡率均不断上升［1］。在肾癌中，肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是最常见的病理类型，病例数约占肾癌病例的75%［2］。肾癌多为偶发，临床症状不明显，有高达17%的肾癌患者在初次就诊时便已发生远处转移［3］。肾癌对放、化疗均不敏感，手术是目前治疗局限性肾癌和局部进展性肾癌的主要方法［3，4］，但仍有近30%的肾癌患者在术后再次出现肿瘤复发和转移［5］。因此，深入探究肾癌发生、发展的相关关键分子，并挖掘相关作用机制，对临床上肾癌的治疗具有十分重要的科学意义。

环状RNA（circular RNAs，circRNAs）是一类广泛存在于真核细胞中的内源性共价闭合环状的非编码RNA。circRNAs表达丰富，广泛存在于细胞、组织、体液中，其半衰期长、结构稳定、耐RNA酶，是较为理想的生物标志物［6，7］。研究发现，circRNAs在多种人类肿瘤中异常表达，环上富含miRNA结合位点、蛋白结合位点、开放阅读框等，可通过作为miRNAs吸附海绵、结合RNA相关蛋白、编码相关蛋白等方式，调控基因表达，在肿瘤发生、发展中起着重要调控作用［8］。

目前虽已有部分研究发现circRNAs在ccRCC中异常表达，并在ccRCC的增殖、迁移和侵袭中发挥着一定作用［6-9］。但circRNAs在ccRCC中的研究仍较少，有待进一步探索。本研究对GEO数据库circRNA芯片数据表达谱进行差异分析，筛选出在ccRCC组织中高表达的circRNA circZBTB44，进一步探究circZBTB44在ccRCC中的表达情况，鉴定相关特征，探究其生物学功能，探索可能的分子机制，希望能为ccRCC的诊断和治疗提供新的生物标志物和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 肾透明细胞癌组织标本

31对肾透明细胞癌组织和配对癌旁组织标本均取自2018年至2020年于中山大学孙逸仙纪念医院接受手术的肾透明细胞癌患者，患者术前均未行化疗或放疗。患者组织的收集与使用均已从每个患者处获得其书面知情同意。所有新鲜的组织收集后，立即使用液氮速冻，后续保存在-80°C冰箱。肾透明细胞癌和癌旁组织均经两名病理科医师确认。本研究已得到中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会的审批。

1.2 肾透明细胞癌细胞系的培养

人肾透明细胞癌细胞株786-O、ACHN和正常肾小管上皮细胞细胞株HK-2均购买于美国ATCC细胞库。其中，786-O和ACHN细胞使用PRMI 1640培养基（Gibco）培养，HK-2细胞使用DMEM/F-12K培养基（Gibco）培养。所有细胞均使用完全培养基（含10%胎牛血清（Gibco）和1%青霉素/链霉素（Hyclone）培养于5%CO2的湿润的37℃细胞培养箱，取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.3 细胞转染

取处于对数生长期的细胞以1.1×105细胞每孔的密度接种于六孔板中，培养过夜。次日按照说明书的步骤使用Lipofectamine RNAiMax（Invitrogen）将阴性对照和circZBTB44的siRNAs转染至细胞中。转染48 h后可进行下一步功能实验，同时可提取RNA进行qRT-PCR验证转染效率。

1.4 RNA的提取及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

按照说明书的步骤使用RNAiso Plus（Takara）提取标本组织或转染后细胞的总RNA，使用Evo M-MLV RT Premix for qPCR（艾科瑞生物）将总RNA逆转录为cDNA，再使用SYBR®Green Premix Pro Taq HSqPCR Kit（艾科瑞生物）按说明书步骤在荧光定量PCR仪LightCycler96（Roche）上进行qRT-PCR反应得到目的RNA逆转录的cDNA及内参GAPDH的Cq值，通过2-ΔΔCq的方法计算相对表达量。本研究使用的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列为：circZBTB44-F：TCCCAGCCTGTCAGTGCATC，circZBTB44-R：GGCTGTGGGAAGAGGAGCTAT；ZBTB44 mRNA-F：CGAGTGCAAAACATGTGGC，ZBTB44 mRNA-R：CACCTCTTGGAATTCATTCTCCG；GAPDH-F：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，GAPDH-R：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。

1.5 放线菌素D实验

取处于对数期生长的细胞接种于六孔板中，每孔7×104个细胞，并置于细胞培养箱中培养24 h后，加入含2μg/mL放线菌素D的新鲜完全培养基，分别于处理后的4 h、8 h、12 h、24 h提取细胞RNA，并逆转录，行qRT-PCR法检测放线菌素D处理后，circRNA和mRNA丰度的变化。

1.6 RNase R实验

提取细胞总RNA，按照说明书步骤，将10 U RNase R（20 U/μL，广州吉赛生物）加入到3μg总RNA中，对照组则将等量DEPC水加入到3μg总RNA中，于37℃孵育30 min后逆转录，并进行qRTPCR。

1.7 核浆分离实验

采用PARISTM试剂盒（Invitrogen）按照说明书步骤，取1×107细胞，加入预冷的500μL Cell Fractionation Buffer冰上裂解，并4℃500×g离心5 min，上清即为胞浆裂解液，沉淀物为细胞核沉淀。细胞核沉淀中加入预冷的500μL Cell Disruption Buffer，用力吹打或涡旋振荡使细胞核充分裂解。往胞浆裂解液和胞核裂解液中加入500μL常温的2×Lysis/Binding Solution，充分混匀后分别过吸附柱提取RNA。

1.8 MTS细胞增殖实验

取siRNA转染48 h后的细胞以每孔1×103个细胞接种于96孔板后，放入37℃，5%CO2培养箱中孵育。在孵育0、24、48、72、96和120小时后，加入20μL MTS溶液（CellTiter 96®AQueous One Solution细胞增殖试剂盒，Promega），37℃温箱孵育2 h，使用酶标仪测定490 nm的OD值。根据测得的OD值绘制MTS细胞增殖曲线。

1.9 克隆形成实验

取siRNA转染48 h后的细胞以每孔1×103个细胞接种于六孔板后，放入37℃，5%CO2培养箱中孵育培养约2周，并观察细胞存活状态和克隆形成情况，每3～4天用换液一次，直到菌落清晰可见。使用PBS洗涤细胞后，使用4%多聚甲醛溶液室温固定25 min，再使用0.1%结晶紫溶液室温染色20 min，流水冲洗晾干后对六孔板进行拍照并计数。

1.10 Transwell细胞迁移实验

取siRNA转染48 h后的细胞，用无血清培养基重悬，配成200μL 8×104个细胞，加入到已提前使用无血清培养基润膜的Transwell小室的上室中，下室加入新鲜的完全培养基600μL，放入培养箱培养4 h（786-O）或3 h（ACHN）后，使用4%多聚甲醛溶液室温固定30 min，再使用0.1%结晶紫溶液室温染色25 min，拍照并计数穿过膜的细胞个数。

1.11 蛋白免疫印迹实验

取siRNA转染48 h后的细胞，使用RIPA蛋白裂解液（北京康为世纪）（含1%蛋白酶抑制剂（北京康为世纪）和1%磷酸酶抑制剂（Roche））裂解细胞获得蛋白制品。使用BCA试剂盒（上海碧云天）测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液（Invitrogen）混匀后100℃煮沸5 min。使用恒压80 V或120 V进行SDS-PAGE凝胶电泳，使用恒流250 mA转膜，使用5%BSA封闭后，一抗4℃慢摇孵育过夜，二抗室温慢摇孵育1 h后，使用ECL发光液在化学发光成像系统中显影，并保存图片。

1.12 统计分析

所有实验均重复三次，并使用软件SPSS 20.0.0和GraphPad Prism 8.0进行统计分析和作图。数据采用均值±SD表示。两组定量资料之间比较采用独立样本t检验。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 circZBTB44在肾透明细胞癌组织和细胞株786-O和ACHN中明显高表达

本研究通过对GEO数据库GSE100186数据集（4对肾透明细胞癌和配对癌旁组织）的circRNA芯片数据表达谱进行差异分析，发现circZBTB44（hsa_circ_0002484）在肾透明细胞癌组织中明显高表达。通过提取收集的本院31对肾透明细胞癌组织和配对癌旁组织标本及肾透明细胞癌细胞株786-O和ACHN的总RNA，进行qRT-PCR检测circ-ZBTB44的表达水平，我们发现，相较癌旁组织，circZBTB44在肾透明细胞癌组织中的明显高表达（图1A）。相较永生化的正常肾小管上皮细胞株HK-2细胞，circZBTB44在肾透明细胞癌细胞株786-O和ACHN中明显高表达（图1B），与数据库结果一致。

图1 circZBTB44在肾透明细胞癌组织和细胞中明显高表达 A：qRT-PCR法检测31对肾透明细胞癌组织与癌旁组织中circZBTB44的表达水平；B：qRT-PCR法检测正常肾小管上皮细胞系HK-2细胞和肾透明细胞癌细胞系786-O和ACHN中circZBTB44的表达水平；**P＜0.05，***P＜0.001

2.2 circ ZBTB44在肾透明细胞癌细胞中的鉴定和特征

通过查询数据库，了解到circZBTB44位于chr11：130130750-130131824，由ZBTB44基因的15、16、17、18号外显子通过首尾相接共价闭合成环，circZBTB44全长1074 bp。

为了验证circZBTB44的环状RNA相关特征，我们用放线菌素D作用于肾透明细胞癌细胞株786-O和ACHN并设置了不同的作用时间，结果提示，circZBTB44的半衰期超过24 h，而线性ZBTB44 mRNA的半衰期约为12 h，表明circZBTB44的结构比线性ZBTB44 mRNA稳定（图2A）。我们进一步从细胞系786-O和ACHN中提取总RNA并利用RNase R消化，然后进行qRT-PCR，结果提示circZBTB44的表达量基本不受RNase R影响，而ZBTB44 mRNA则显著降低，提示circZBTB44在一定程度上能够耐受核酸外切酶的作用（图2B）。

为了进一步明确circZBTB44在786-O和ACHN中的定位，以U6（定位于细胞核）和18SrRNA（定位于细胞浆）为内参，通过核浆分离实验，我们发现circZBTB44在细胞浆的水平明显高于细胞核水平（图2C），提示circZBTB44主要定位于肾透明细胞癌细胞的胞浆内。

图2 circ ZBTB44在肾透明细胞癌细胞中的鉴定和特征A：qRT-PCR法检测不同时间的放线菌素D作用下，786-O和ACHN的circZBTB44和ZBTB44 mRNA的表达水平；B：qRT-PCR法检测RNaseR作用下，786-O和ACHN的circZBTB44和ZBTB44mRNA的表达水平；C，核浆分离实验提示circZBTB44主要分布在细胞浆中；*、**P＜0.05，***P＜0.001

2.3 siRNAs能有效下调circZBTB44的表达水平

为了探究circZBTB44在肾透明细胞癌细胞中的生物学功能，我们设计合成了两条circZBTB44特异性siRNAs（si#1和si#2）。利用siRNAs转染技术，向肾透明细胞癌细胞株786-O和ACHN转染si#1和si#2或阴性对照序列。通过qRT-PCR方法检测转染效率，发现与对照组（NC组）相比，si#1和si#2能有效下调circZBTB44的表达水平，而对ZBTB44 mRNA的表达无明显影响（图3）。

图3 si#1和si#2能有效下调circZBTB44的表达水平qRTPCR法检测转染circZBTB44特异性siRNAs（si#1和si#2）后，786-O和ACHN的circZBTB44和ZBTB44mRNA的表达水平；***P＜0.001

2.4 下调circZBTB44抑制肾透明细胞癌细胞的增殖和迁移能力

通过MTS细胞增殖实验，发现与NC组相比，通过si#1和si#2下调circZBTB44可明显抑制肾透明细胞癌细胞株786-O和ACHN细胞增殖（图4A）。通过克隆形成实验，发现si#1和si#2组细胞形成克隆数目低于NC组（图4B）。以上结果表明，下调circZBTB44明显抑制肾透明细胞癌细胞的增殖能力。

进一步探究下调circZBTB44对肾透明细胞癌细胞迁移能力的影响，利用Transwell小室进行体外迁移实验。结果表明，与NC组相比，si#1和si#2组细胞迁移能力明显被抑制（图4C）。综上结果，circZBTB44在肾透明细胞癌中发挥着促癌作用，下调circZBTB44抑制肾透明细胞癌细胞的增殖和迁移能力。

2.5 circZBTB44可能通过调控AKT通路促进肾透明细胞癌细胞的增殖和迁移

上述结果证明circZBTB44在肾透明细胞癌中发挥着促癌作用。进一步探究circZBTB44可能的分子作用机制，通过对circZBTB44的亲本（host）基因进行基因富集分析（GESA）。我们发现一些肿瘤相关的信号通路有富集，如P53通路、AKT通路、TGF-β通路（图5A）。通过对这些通路的关键蛋白进行蛋白免疫印迹检测，我们发现，与对照组相比，通过si#1和si#2下调786-O和ACHN细胞circ-ZBTB44的表达后，p-AKT表达量明显减少，而PI3K表达量及P53、TGF-β通路未见明显变化（图5B），提示circZBTB44可在一定程度上促进AKT的磷酸化。综上结果，circZBTB44可能通过调控AKT通路促进肾透明细胞癌细胞的增殖和迁移。

图4 下调circZBTB44抑制肾透明细胞癌细胞的增殖和迁移能力 A：MTS细胞增殖实验检测细胞转染siRNAs后的增殖能力；B：克隆形成实验检测细胞转染siRNAs后的克隆形成能力；C：Transwell小室检测细胞转染siRNAs后的迁移能力；**P＜0.005

3 讨论

近年来，随着高通量测序技术的快速发展，越来越多的circRNAs被发现，逐渐成为科学探究的热点。circRNAs表达丰富，结构稳定，是较为理想的生物标记物［10，11］。越来越多的研究发现，circRNAs在人类多种肿瘤组织中异常表达，并可通过作为miRNAs吸附海绵、结合RNA相关蛋白、编码相关蛋白等方式，调控肿瘤细胞的基因表达，进而影响肿瘤发生、发展［12］。如Has_circ_100395通过吸附miR-1228调控TCF21通路调控肺癌的进展［13］。circFoxo3直接结合p21、CDK2，共同形成三元复合物，进而调控细胞周期进程［14］。顺式circCTNNB1通过调控DDX3介导的YY1转录激活，调控Wnt/β-catenin信号通路，进而调控肿瘤的进展［15］等。目前circRNAs在肾透明细胞癌中的研究仍较少，其在肾透明细胞癌中的生物学功能和具体调控机制尚不明确，仍待进一步探索。PI3K/AKT信号通路是一条十分重要的信号通路，在细胞的生理、病理变化中都起着重要的作用。PI3K/AKT信号通路是肾透明细胞癌中最常见的反复突变的信号通路之一［16］，PI3K/AKT信号通路被各种因素异常激活或失活，引起下游通路的改变，进而影响肾透明细胞癌的增殖、迁移、侵袭、EMT等能力［17］。如PTPN3基因通过抑制肾透明细胞癌细胞的PI3K/AKT信号通路，抑制肾透明细胞癌的增殖和转移［18］。酰基甘油激酶可通过激活PI3K/AKT/GSK3β信号通路促进肾透明细胞癌的生长和转移［19］等。

图5 circZBTB44可能通过调控AKT通路促进肾透明细胞癌细胞的增殖和迁移 A：基因富集分析（GESA）探究circZBTB44可能的分子作用机制；B：蛋白免疫印迹实验检测细胞转染siRNAs后PI3K/AKT通路、P53通路、TGF-β通路的关键蛋白表达量的变化。

本研究通过分析GEO数据库中肾透明细胞癌与癌旁组织circRNA芯片数据的差异表达，发现circZBTB44在肾透明细胞癌组织中明显高表达，并在本院31对肾透明细胞癌组织及细胞系786-O和ACHN得到了验证。通过放线菌素D实验和RNase R实验验证了circZBTB44结构较ZBTB44 mRNA稳定的特征，并通过核浆分离实验确定circZBTB44定位于胞浆。体外实验中，通过下调circZBTB44的表达水平，发现786-O和ACHN细胞的增殖和迁移能力均被明显抑制。进一步探究发现，下调circZBTB44的表达可抑制AKT的磷酸化，提示circZBTB44可能通过促进AKT的磷酸化，激活PI3K/AKT信号通路，进而发挥其促癌作用，促进肾透明细胞癌细胞的增殖和迁移。然而circZBTB44具体调控PI3K/AKT信号通路的分子机制仍不明确，本研究验证了circZBTB44主要分布于细胞浆，通过数据库发现circZBTB44环上有较多miRNA和RNA相关蛋白结合位点，后续将结合生物信息学分析预测并进行验证，继续深入探索circZBTB44的分子机制。

综上所述，本研究发现circZBTB44在肾透明细胞癌组织和细胞中均高表达，circZBTB44可能促进AKT的磷酸化，激活AKT信号通路，促进肾透明细胞癌的增殖和迁移能力，有望成为肾透明细胞癌治疗的潜在新靶点。