金线莲花药发育中的钙离子分布特征

陈育青，李秋静，赖钟雄，林美珍*

(1 漳州卫生职业学院 药学系，福建漳州 363000；2 福建农林大学 园艺植物生物工程研究所，福州 350002)

金线莲(Anoectochilusroxburghii)是兰科(Orchidaceae)多年生草本植物，主产于福建、浙江、云南等地。金线莲具有祛风利湿、平衡阴阳、扶正固本、消炎解毒、清热凉血等功效，民间常煲汤、泡茶、煎煮等做成药膳，用于润肺止咳、保肝降脂、降血糖血压、抗肿瘤及提高免疫力等治疗，是一种经济价值较高的功能性药食两用植物[1]。目前市场上产业化栽培金线莲均是组培苗繁殖，导致物种退化。探索金线莲有性繁殖特性是保护金线莲种质资源、发展金线莲产业的关键研究基础。然而，有关金线莲的有性繁殖研究极少报道，大多数基础研究集中在其药效成分和药理作用。

钙是植物生命中的基本元素，调控许多重要的生理代谢活动[2-3]。钙离子在植物细胞中的生理功能已有报道[4-6]，高等植物有性生殖过程中钙离子的分布特征和生理功能也有报道[7]。花药是植物雄性器官，结构复杂，其发育是一个精确调控的生物学过程。大多数植物的花药壁由4层药壁细胞组成，它们紧密相连，但形态、结构和功能不同。花粉(雄配子体)的发育伴随着一系列细胞形态和结构的变化，有些变化显示出钙离子参与调控花药发育，但因植物种类不同而异。前期作者团队已对金线莲花药发育的结构特征进行了研究[8]，本研究对金线莲花药发育中钙离子的分布特征及其生理功能进行分析讨论。

1 材料和方法

实验材料来自于福建省漳州市南靖草本养生生物科技有限公司的二年生组培苗，经鉴定为兰科金线莲(Anoectochilusroxburghii)。金线莲常在11-12月开花，总状花序由2～6朵花组成，每星期取样1次，共取样8次，每次采集约20个花药。先将花药固定在由0.1 mol/L的磷酸缓冲液配制的2.5%(V/V)戊二醛固定液中[固定液中还加入1%焦锑酸钾(K2H2Sb2O7·4H2O)固定钙离子]。组织细胞中的钙定位原理是锑可与钙结合形成焦锑酸钙沉淀颗粒，在电子显微镜观察中，电子束不能穿过沉淀颗粒而形成黑色斑点[9]。各时期花药在戊二醛前固定液中室温固定3 h。用含1%焦锑酸钾的0.1 mol/L磷酸缓冲液换洗3次，每次30 min。之后，已换洗的花药在含1%锇酸和1%焦锑酸钾的后固定液中4 ℃再固定12 h。用双蒸水换洗3次后，系列丙酮脱水，Epon 812树脂渗透、包埋。包埋的花药用Leica Ultracut R超薄切片机做70 nm厚的切片，用醋酸2%双氧铀染色20 min。切片干燥后用透射电子显微镜(日立HT-7800，日本)观察、拍照。

2 结果与分析

金线莲花冠为左右对称，外形呈蜘蛛状，唇瓣2裂，裂片舌状条形，中间颈部的两侧各具5～6枚流苏状细裂条(图版Ⅰ，A)。金线莲每花有2个呈水滴状的花药，2个花药下方基部相连(图版Ⅰ，B)。剥开花药，可见许多呈条形的花粉块。花粉块的形态大小不一，有的呈一端大一端小的镰刀形，有的呈长条形或索状，其体积相差较大(图版Ⅰ，C)。

花药包括花药壁和药室，在药室中产生小孢子，并逐渐发育形成雄配子体，即花粉。本研究结果根据金线莲花药的发育过程，分别描述其钙离子的分布特征。

2.1 花药壁特征及钙离子分布

在花药发育早期，花药壁结构由外向内为表皮(Ep)、药室内壁(En)、中层(ML)和绒毡层(T)组成。在造孢细胞时期，花药壁细胞已明显分化，表皮和药室内壁细胞开始液泡化，但中层和绒毡层细胞的液泡化程度很低。绒毡层以内为造孢细胞(SC)，可见小液泡(图版Ⅰ，D)。在开始液泡化的表皮细胞，其液泡(V)的表面上分布较多钙沉淀颗粒(图版Ⅰ，E)，显示钙离子与表皮细胞中的液泡形成有关。表皮细胞中一些质体合成淀粉粒(S)的现象也很明显。花药壁的最内层是绒毡层细胞(T)，这些细胞中有一个大的细胞核(n)，含有浓厚的细胞质。虽然在绒毡层细胞之间的径向壁中有一些钙沉淀颗粒，但在绒毡层细胞内钙沉淀颗粒很少(图版Ⅰ，F)。在绒毡层内切向面的药室内为造孢细胞(SC)。造孢细胞的细胞壁有差异，一些较厚的细胞壁(箭头所示)已显示条形花粉块的界限(图版Ⅰ，G)。在花粉块内造孢细胞之间的壁较薄，与花粉块界壁有一定区别，显示金线莲花粉块的形成在造孢细胞时期就已确定。

2.2 造孢细胞时期钙的分布特征

造孢细胞的细胞核大，占据了细胞中央大部分空间。细胞核中的核仁清晰，染色质无规律分布。造孢细胞的四周细胞壁厚薄不同，较厚的为花粉块的界壁，较薄的为花粉块内部的细胞壁。造孢细胞中一些细胞器和小液泡分散在细胞核周围(图版Ⅰ，H)。在造孢细胞的细胞壁中钙沉淀颗粒较大，细胞质中钙沉淀颗粒较小。造孢细胞中的钙沉淀颗粒分布有一定特异性，细胞质中的钙沉淀颗粒主要分布在液泡(V)和质体(P)表面(图版Ⅰ，I)。当质体表面附有较多钙沉淀颗粒时，质体内部开始出现淀粉粒(图版Ⅱ，A)，暗示钙离子可能与淀粉合成有关。在细胞核中有较多的钙沉淀颗粒，主要分布在核质部位，染色质中钙沉淀颗粒较少(图版Ⅱ，B)，呈现出钙沉淀颗粒特异分布。

图版Ⅰ 金线莲花和花药结构A.金线莲花形态；B.金线莲的花药；C.金线莲的花粉块；D.金线莲花药横切，示花药壁结构：表皮(Ep)、药室内壁(En)、中层(ML)、绒毡层(T)、造孢细胞(SC)；E.花药表皮细胞(Ep)结构和其中的钙沉淀颗粒分布，淀粉粒(S)、液泡(V)；F.花药绒毡层细胞(T)结构和其中的钙沉淀颗粒分布；G.花药中部的造孢细胞(SC)出现了花粉块的界限(箭头)；H.示花粉块中的造孢细胞(SC)和细胞核(n)；I.造孢细胞(SC)中的钙沉淀颗粒分布在液泡(V)和质体(P)表面Plate Ⅰ Flower and anther structure of Anoectochilus roxburghiiFig. A. Flower morphology of A.roxburghii; Fig.B. Anther of A.roxburghii; Fig.C. Pollinium of A.roxburghii; Fig.D. Cross section of the anthers shows anther wall structure: epidermis (Ep), endothecium (En), middle layer (ML), tapetum (T), sporogenous cell (SC); Fig.E. Structure of anther epidermal cells (Ep) and distribution of calcium precipitates in it. Starch (S), Vacuole (V); Fig.F. Anther tapetum cell (T) structure and distribution of calcium precipitates in it; Fig.G. The sporogenous cell (SC) in the middle of the anther appear the boundary of pollinium (arrow); Fig.H. Show the sporogenous cell (SC) in the pollinium and nucleus (n); Fig.I. Calcium precipitates distribution on the surface of vacuole (V) and plastid (P)

2.3 小孢子母细胞时期钙的分布特征

由造孢细胞发育到花粉母细胞时期常有一些区分特征。但金线莲是花粉块发育，未观察到植物经典花粉母细胞的形态，只能根据取材时间和细胞的结构特征来确定小孢子母细胞时期。金线莲小孢子母细胞的明显特征是分裂前染色质(体)靠核膜分布(图版Ⅱ，C)。与造孢细胞相比，小孢子母细胞的结构没有很大变化，细胞质中质体和液泡明显，但其他细胞器难以区分；细胞中的钙沉淀颗粒仍然较多分布在细胞核基质中，在染色质中较少，同时细胞质中的钙离子颗粒也较少(图版Ⅱ，D)。然而，分裂前的小孢子母细胞核中的钙沉淀颗粒数量明显增加，主要仍然分布在核基质中(图版Ⅱ，E)。伴随着小孢子母细胞的分裂，核膜破裂，染色(质)体分为二组排列，之间有大量的钙沉淀颗粒分布(图版Ⅱ，F)，暗示钙离子可能参与调控小孢子母细胞的分裂过程。在小孢子母细胞的细胞壁中，钙沉淀颗粒数量明显增加。细胞中小液泡和质体仍然明显可见，其他细胞器则不多(图版Ⅱ，G)。与造孢细胞相比，小孢子母细胞的质体(P)表面钙沉淀颗粒明显增多，并伴随着质体内淀粉粒的形成(图版Ⅱ，H)。

图版Ⅱ 金线莲早期花药中的钙离子分布特征A.造孢细胞中的质体(P)表面分布有较多的钙沉淀颗粒；B.造孢细胞核(n)中有较多的钙沉淀颗粒，但染色质(C)中钙沉淀颗粒较少；C.小孢子母细胞(MMC)时期，染色质靠核膜分布；D.示小孢子母细胞的细胞质中较少钙沉淀颗粒；E.分裂前的小孢子母细胞核(n)中，钙沉淀颗粒达到最多；F.分裂中的小孢子，二组染色体(c)之间分布大量的钙沉淀颗粒；G.小孢子母细胞中的液泡(V)表面和细胞壁(W)分布一些钙沉淀颗粒；H.小孢子母细胞中，一些质体(P)表面出现钙沉淀颗粒并形成淀粉粒Plate Ⅱ Characteristics of calcium distribution in the early anthers of Anoectochilus roxburghiiFig.A. Calcium precipitates distribution on the surface of the plastid (P) in sporogenous cells (SC); Fig.B. There are more calcium precipitates in the nucleus (n) of sporogenous cell, but less in chromatin (C); Fig.C. At the microspore mother cell (MMC) stage, chromatin is distributed along the nuclear membrane; Fig.D. A fewer calcium precipitates distribution in the cytoplasm of microspore mother cells; Fig.E. The maximum calcium precipitates were accumulated in the nucleus (n) of microspore mother cell before meiosis; Fig.F. When the microspore mother cell divided, a large number of calcium precipitates appeared between the two sets of chromosomes (C); Fig.G. Some calcium precipitates distributed on the vacuole (V) surface and the cell wall (W) of microspore mother cells; Fig.H. Calcium precipitates appeared on the surface of plastids (P) and formed starch granules in the microspore mother cells

2.4 小孢子时期钙的分布特征

金线莲小孢子母细胞减数分裂后形成的小孢子仍然聚集在一起，以花粉块的方式发育。由于花粉块由数十个甚至上百个花粉组成，位于花粉块不同部位的花粉发育特性不同，最显著的特征是位于花粉块表面花粉和内部花粉的胼胝质壁和花粉外壁发育的差异性。金线莲花粉母细胞时期在整个花粉块表面形成了一层厚厚的含多糖的胼胝质壁，但在花粉块内部的花粉母细胞表面则没有胼胝质壁的形成。减数分裂后，在早期花粉块表面仍可看到厚厚的胼胝质壁，但在小孢子径向面和内切向面，则没有胼胝质壁结构。在花粉块内部的小孢子表面上也没有胼胝质壁。虽然在小孢子径向壁部位胼胝质壁分叉，但没有继续长入(箭头)(图版Ⅲ，A)。显微放大后清晰显示在小孢子和胼胝质壁之间已开始形成花粉外壁结构(箭头)。这一结构特征也是确定小孢子的依据。在花粉外壁和胼胝质壁之间，有1层片状网格结构，可能是胼胝质壁开始降解的产物。在胼胝质壁表面，有少量体积较大的钙沉淀颗粒，在胼胝质壁(CW)中，钙沉淀颗粒较小，数量较多。在花粉外壁部位，也有一些钙沉淀颗粒，但在小孢子细胞质中，钙沉淀颗粒很少(图版Ⅲ，B)。在花粉块内部，小孢子细胞壁中有较多的钙沉淀颗粒，而在细胞质中的钙沉淀颗粒依然很少(图版Ⅲ，C)。随着小孢子的发育，在小孢子细胞壁中钙沉淀颗粒明显增加，小孢子细胞质中钙沉淀颗粒也增加(图版Ⅲ，D)。从小孢子时期的钙沉淀颗粒分布动态来看，钙离子呈现移入小孢子中的趋势。

2.5 二胞花粉时期钙的分布特征

金线莲花粉为二胞型，成熟花粉中含1个生殖细胞和1个营养细胞。小孢子分裂后，二胞花粉开始积累淀粉和脂滴的营养物质[8]。本实验中，可看到成熟花粉的外形不规则，在花粉中积累了许多淀粉粒。在花粉块表层上已形成了完整的花粉外壁，与其他植物的孢粉素花粉外壁相似，但花粉块内部的花粉则没有花粉外壁结构，或者花粉外壁不完整(图版Ⅲ，E)。在成熟花粉块表面的花粉外壁上(Ex)分布了1层钙沉淀物(箭头所示)，在外壁的空隙中也积累了一些钙沉淀颗粒。花粉中有大量淀粉粒(S)(图版Ⅲ，F)。在成熟花粉的细胞质中钙沉淀颗粒主要分布在淀粉粒附近(图版Ⅲ，G)，或被聚集在小泡中(箭头所示)(图版Ⅲ，H)。金线莲成熟花粉中呈现较丰富的钙离子。

图版Ⅲ 金线莲晚期花药中的钙离子分布特征A.减数分裂后的小孢子(M)，示花粉块表面的胼胝质壁(CW)，箭头示花粉径向壁部位；B.小孢子(M)合成花粉外壁(箭头)，在胼胝质壁(CW)中分布一些钙沉淀颗粒；C.花粉块内小孢子(M)之间的壁中出现一些钙沉淀颗粒；D.随着花粉块的发育，小孢子(M)之间的壁中钙沉淀颗粒明显增加；E.开花时，花粉块中的成熟花粉积累了大量的淀粉粒；在花粉块的表面有一层花粉外壁，但块内花粉之间无花粉外壁；F.在花粉外壁(Ex)表面附有一层钙沉淀颗粒(箭头)，花粉中有大量淀粉粒(s)；G.成熟花粉，钙沉淀颗粒分布在淀粉粒(S)附近；H.成熟花粉，钙沉淀颗粒聚集在细胞质小泡中(箭头)Plate Ⅲ Characteristics of calcium distribution in the late anthers of Anoectochilus roxburghiiFig.A. Shows the callose wall (CW) on the surface of pollinia and the arrows show the radial wall of pollen in the microspore (M) after meiosis; Fig.B. Microspores (M) synthesize the outer wall of pollen (arrow) and distribute some calcium precipitates in the callose wall (CW); Fig.C. Some calcium precipitates appear in the wall between microspores (M) inside pollinia; Fig.D. With the development of pollinia, calcium precipitates increased significantly in the walls between microspores (M); Fig.E. At flowering, the mature pollen in pollinia accumulated a large number of starch grains. There is a layer of pollen outer wall on the surface of pollinia, but there is no pollen outer wall between the pollens within pollinia; Fig.F. There is a layer of calcium precipitates (arrow) on the outer wall (Ex) of the pollen and there are a large number of starch grains (S) in the pollen; Fig.G. There are many calcium precipitates near starch granules of mature pollen; Fig.H. Calcium precipitates gather in cytoplasmic vesicles (arrow) of mature pollen

3 讨 论

我们已在前期报道了金线莲花药发育的特殊性，即金线莲花药以花粉块的形式发育[8]，在造孢细胞时期确定了花粉块的轮廓；在造孢细胞向小孢子母细胞转变过程中，花粉块内细胞之间发生细胞器和细胞核的穿壁现象，且在花粉块表面形成了胼胝质壁,但在花粉块内部的小孢子母细胞之间没有胼胝质壁。减数分裂后，以花粉块为单位在其表面形成孢粉素花粉外壁，但在花粉块内部的花粉没有花粉外壁结构[8]。这些金线莲花粉发育的特异性显示与其他游离花粉发育有很大差异。本研究进一步探索其花药发育过程中的钙离子分布特征，进而讨论钙离子在金线莲花粉发育中的生理功能。

花药是植物的雄性器官，其发育的调控机制还不清楚。在小麦[10]中，可育花药在特定时期和特定部位聚集了较多的钙离子，而在不育花药中钙离子的分布呈现异常，表明花粉发育与钙离子有特定的关系。在莴苣[11]和油茶[12]花粉发育的钙离子分布研究中，表明钙离子含量最高的时期是小孢子时期，尤其在液泡中，显示钙离子与液泡的代谢有关。对羊蹄甲[13]花粉发育的深入研究证实，小孢子细胞质中线粒体积累钙离子后，其内膜(嵴)分解，转变为小液泡，这些小液泡膨大最终融合形成一个大液泡，占据小孢子绝大部分空间并将细胞核挤到边缘，形成单核靠边小孢子。这些研究结果表明钙离子在植物花粉发育的某些环节中具有重要的生理功能。

其他植物花药发育中钙离子的分布特征可见报道[10-13]，但兰科植物花粉发育中钙离子的分布特征和生理功能研究尚未见报道。本研究发现金线莲花药以花粉块形式发育，其钙离子呈现特异性的分布特征：造孢细胞时期，在花药表皮细胞和药室内壁细胞的液泡中分布较多的钙沉淀颗粒，显示钙离子与植物细胞中的液泡发生和形成有关；在减数分裂前期，小孢子母细胞核中聚集了较多的钙沉淀颗粒，当小孢子母细胞分裂时，大量的钙沉淀颗粒分布在二组染色体之间，显示钙离子与细胞分裂有关；同时，在合成淀粉的质体表面覆盖了较多的钙沉淀颗粒，显示钙离子与花粉细胞中的质体糖代谢功能有关；开花时，花粉块表面的花粉外壁上附有1层钙沉淀颗粒，成熟花粉细胞质中仍有大量的钙沉淀颗粒被聚集到小泡中，提示成熟花粉中的钙沉淀颗粒作为储备钙离子，为以后花粉萌发时提供钙离子。金线莲花粉发育中钙离子的特异时空分布暗示其参与花粉发育的代谢活动。