长链非编码RNA TPT1-AS1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

贺伯伟，王鹏国

肺癌是最常见的癌症，其中85%的病人为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），据统计，经手术治疗后约40%NSCLC 病人，会因癌细胞转移复发或死亡，严重危害人们身体健康。因此，找寻与NSCLC 疾病进展密切相关的生物标志物，是寻找新型靶向药物的基础。近来研究发现转录生成的RNA，只有2%左右序列进行编码蛋白质，其它的称均不编码蛋白称为非编码RNA。非编码RNA分为长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和小非编码RNA（small non-coding RNA，sncRNA），lncRNA 与肿瘤细胞的增殖、凋亡密切相关。研究发现，lncRNA 异常表达与乳腺癌、胃癌、肾细胞癌等多种肿瘤发生发展密切相关。已有研究发现，lncRNA TPT1-AS1在脑胶质瘤、肝癌中有重要的作用，但在非小细胞肺癌少有报道，本研究通过观察TPT1-AS1 在非小细胞肺癌中的表达，分析其与临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取 2014 年 7 月至 2016 年 9 月陕西省核工业二一五医院非小细胞肺癌病人，手术切除非小细胞癌组织100 例、癌旁肺组织100 例。病人男性 65 例，女性 35 例，年龄（54.70±6.21）岁。纳入标准：（1）经诊断确诊为非小细胞肺癌病人；（2）所选病人术前未进行过化疗和放疗；（3）病人生存期不小于3 个月，排除标准：（1）无明确的病灶；（2）患有严重心脑血管疾病的病人；（3）患有精神障碍疾病的病人。样本在－80 ℃冰箱保存。所有病人均签订知情同意书。术后对所有病人进行随访，统计病人生存情况，以病人死亡为终点事件，随访截止时间2019 年2 月。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 试剂及仪器

PrimeScript RT reagent Kit（货号RR047A）购 自 日 本 TAKARA 公 司 ；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（货号Q111-02）购自南京诺唯赞生物科技有限公司；BCA 蛋白浓度检测试剂盒（货号P0010S）购自上海碧云天公司；TRizol试剂（货号TR118-100）购自上海素尔生物科技有限公司；酶标仪（型号Multiskan GO）、超低温冰箱（型号MDFU32V）购自美国 Thermo 公司；Real time-PCR 所需引物由生工生物工程上海股份有限公司合成。

1.3 方法

定量聚合酶链反应（qPCR）：（1）提取组织RNA：取100 mg肺癌组织及癌旁组织于试管内然后加1 mL Trizol，用研磨器在冰上研磨45 s 制备组织匀浆液，加入氯仿和异丙醇提取RNA，加20～50 μL RNase-free 水溶解完全后，测浓度。按照Prime-Script RT reagent Kit 说明书进行逆转录操作，体系为10 μL，在冰盒上进行操作。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）体系按照试剂盒说明书进行配制，总体积20 μL，每个样本设置3 个重复，GAPDH 为内参，PCR 反应条件：预变性：95 ℃，30 s，40 个循环，95 ℃，10 s，60 ℃，20 s，延伸：70 ℃，10 s，反应结束后，TPT1-AS1 相对表达量用 2计算，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结果

2.1 lncRNA TPT1

-

AS1 在非小细胞肺癌中的相对表达

经qRT-PCR 检测后，与癌旁肺组织相比，非小细胞肺癌组织中TPT1-AS1 表达水平显著升高［（2.18±0.16）比（0.91±0.12），

t=

63.500，

P

＜0.05］。

2.2 lncRNA TPT1

-

AS1 的表达与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

100 例非小细胞肺癌病人按照lncRNA TPT1-AS1 平均表达水平将非小细胞肺癌组分为lncRNA TPT1-AS1 高表达组59 例和低表达组41 例，分析lncRNA TPT1-AS1 在非小细胞肺癌病人中的表达与临床病理特征的关系结果表明，lncRNA TPT1-AS1 在非小细胞肺癌病人组织中的表达与淋巴转移、TNM 分期有关（

P

＜0.05），与病人的性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、分化程度无关（

P

＞0.05）。见表2。

表2 TPT1-AS1的表达与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

2.3 lncRNATPT1

-

AS1 表达对病人生存关系的影响

lncRNATPT1-AS1 高表达组 NSCLC 病人 3 年存活率为10.17%，lncRNATPT1-AS1 低表达组NSCLC病人3 年存活率为41.46%，log-rank 检验显示，与lncRNA TPT1-AS1 低表达组相比，高表达者生存率显著降低（

χ

=13.376，

P

＜0.001）。

2.4 预后影响因素分析

单因素分析显示，lncRNATPT1-AS1表达、TNM 分期、淋巴转移是非小细胞肺癌病人预后的危险因素。多因素分析显示，lncRNATPT1-AS1 表达和TNM 分期是影响非小细胞肺癌病人预后的独立危险因素（HR=1.954，95%

CI

为1.545～2.473，

P

＜0.05；HR=2.013，95%

CI

为1.591～2.547，

P

＜0.05）。见表3。

表3 影响非小细胞肺癌病人预后的危险因素分析结果

3 讨论

肺癌主要分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC），其中NSCLC 是肺癌中发病率最高，根据其病理学形态和临床特征可以分为：腺癌、鳞癌、大细胞癌等。近年来，常规化学疗法和放射疗法已取得较好发展，是肺癌病人治疗的重要手段，NSCLC 发生受多种基因的调控，目前其发病机制尚不明了。因此，加强分子水平研究NSCLC 发生发展相关因子，寻找新的治疗靶点有利于NSCLC 的诊治及预后。

长链非编码RNA（lncRNA）是长度超过200 个核苷酸的非编码RNA，缺少完整功能性的开放阅读框，水平表达低，无蛋白编码能力，但可以通过与RNA 结合蛋白互作，调控其靶基因启动子，还可在转录或转录后调控基因表达。Schmitz 等研究报道lncRNA 在基因控制发育和分化以及人类疾病中发挥多中功能，Zhang 等研究发现，lncRNATUG1 通常在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中被下调，TUG1 敲低促进体外和体内的肿瘤细胞增殖。Chen等研究发现，lncRNA HULC 在多种肿瘤中的预后效果密切相关。Liu 等研究发现，lncRNA XLOC的异位表达促进胃癌细胞活力，迁移和侵袭，导致转移加速，而lncRNA XLOC 表达降低则阻碍细胞迁移和侵袭。Jiang 等发现，通过调控 LncRNA EGFR 表达，可以促进Treg 细胞分化。综上所述，异常的lncRNA 在各种生物学过程中发挥关键作用，包括细胞分化，增殖，凋亡，迁移，侵袭等。目前，大量研究结果表明，多种lncRNA 在肺癌中起着抑制或促进的调控作用。本研究发现，lncRNA TPT1-AS1在NSCLC 的癌组织中的表达显著高于癌旁组织，提示lncRNA TPT1-AS1可能在NSCLC中是促癌因子。

Lu 等研究表明，LncRNA AFAP1-AS1 在肝细胞癌和肝内胆管癌中表达均上调，与癌症的恶化程度及预后密切相关。本研究结果与此类似：lncRNA TPT1-AS1 表达与NSCLC 病人临床病理学特征的相关性，结果显示，lncRNA TPT1-AS1 在 NSCLC 癌组织相对表达量与淋巴转移、TNM 分期显著相关，提示lncRNA TPT1-AS1 的表达可能与NSCLC 的发生发展过程相关。通过对研究组生存相关分析，发现lncRNA TPT1-AS1 高表达组病人生存率显著降低于lncRNATPT1-AS1 低表达组NSCLC 病人，进一步多因素分析结果显示，lncRNA TPT1-AS1 表达和TNM分期是影响NSCLC 病人预后的独立危险因素，提示lncRNA TPT1-AS1 表 达 和 TNM 分 期 与 NSCLC 病 人预后密切相关，可能通过检测lncRNA TPT1-AS1 表达监测NSCLC病人病情发展，评估病人预后。

综上所述，研究 lncRNA TPT1-AS1 在 NSCLC 病人癌组织中高表达，与NSCLC 的发生发展相关，对NSCLC 病人预后评估有一定的指导意义。由于本研究临床样本的数量和地域有局限性，需要扩大样本，并且需要进一步研究lncRNA TPT1-AS1 的分子作用机制，为NSCLC 的早期筛查和预后判断提高更多的理论依据。