微小RNA361-5p在肺结核病人血清中水平及意义
2021-07-28贾宗岭单富强葛国昌赵幸娜
贾宗岭，单富强，葛国昌，赵幸娜
肺结核是临床常见的由结核分枝杆菌导致的严重传染性疾病，其发病率和病死率极高，给病人心理及生理带来沉重负担。肺结核发病除与肺部感染结核菌有关外，还与表达异常的微小RNA（microRNA，miRNA）和炎症因子密切相关。miR-140在肺结核病人外周血中表达异常，其可能通过调节促炎因子水平参与并影响肺结核发病进展。miR-361-5p 在肺结核病人血浆中呈高表达，可作为肺结核诊断的有效标志物。此外，结核分枝杆菌入侵人体时，机体会产生大量炎症反应相关因子，其水平可一定程度用于筛查肺结核，炎症反应相关因可能在结核病发生发展过程发挥重要作用。但微小RNA-361-5p（miRNA-361-5p，miR-361-5p）在肺结核血清中的表达水平及意义鲜有研究。本研究通过初步检测miR-361-5p 在肺结核中血清中的水平，分析miR-361-5p 与炎症相关因子的关系，以期为诊治肺结核提供依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取 2017 年 3 月至 2019 年 1 月开封市结核病防治所诊治的肺结核病人136例进行研究（肺结核组），男 76 例，女 60 例；年龄（44.01±10.52）岁，年龄范围为 31～57 岁；体质量指数（BMI）（20.84±2.87）kg/m，BMI 范围为 17.01～24.86 kg/m。并以同期本院体检正常者142 例进行对照研究（健康对照组），男 78 例，女 64 例；年龄（43.94±10.47）岁，年龄范围为29～56岁；BMI为（21.08±2.93）kg/m，BMI 范围为 17.25～25.09 kg/m。两组年龄、性别、BMI比较，差异无统计学意义（P
＞0.05）。纳入标准：（1）符合《肺结核诊断和治疗指南》中肺结核诊断标准者；（2）病历资料齐全者；（3）病人本人自愿参该项研究，并签署知情同意书。排除标准：（1）合并糖尿病、心肝肾功能异常、肺癌者；（2）合并过敏体质者或妊娠、哺乳期女性；（3）合并精神类障碍或其他免疫、慢性疾病者；（4）近期使用糖皮质激素、抗感染、免疫等影响炎症反应药物者。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。
1.2 方法
1.2.1
样本收集 采集肺结核病人入院第二日及体检正常者清晨空腹肘静脉血约5～6 mL，室温下静置约30 min，以3 500 r/min 离心 5 min，收集上清，分装于1.5 mL EP 管中，密封，储存于-80 ℃冰箱中，备用。1.2.2
实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测血清中miR-361-5p 表达水平 取出-80 ℃中适量血清样本，无菌环境下，冰上解冻，按TRIzol 法提取总RNA，具体操作按TRIzol试剂（BYX1617P，常州贝源鑫生物科技有限公司）说明书进行。以紫外分光光度计（Nano EX，泽尼萨尔有限公司）检测RNA 浓度、纯度，并验其完整性。根据miScript Reverse Transcription Kit（218061，上海北诺生物科技有限公司）说明书将RNA 逆录成cDNA。利用TaqMan® Fast Advanced Master Mix（4444557，杭州沃森生物技术有限公司）及PCR 仪（Rotor-Gene Q，凯杰企业管理有限公司）将cDNA 扩增，qPCR 检测。miR-361-5p以 U6 为内参，其应引物序列如表 1 所示。以 2法计算miR-361-5p相对表达量。
表1 miR-361-5p及内参U6的引物序列
1.2.3
血清血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、γ-干扰素（IFN-γ）水平检测 从-80 ℃冰箱中取出分装的血清样本，室温下解冻，利用人VEGF 酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（货号：KHG0111，上海研卉生物科技有限公司）、TNF-α ELISA 试剂盒（OSD_H0170，长沙达尔锋生物科技有限公司）、IFN-γ ELISA 试剂盒（BS-E3748H1，广州徕智生物科技有限公司）按ELISA 法测定血清VEGF、TNF-α、IFN-γ水平。
2 结果
2.1 两组血清
miR
-361
-5p、VEGF、TNF
-α、IFN
-γ水平比较
与健康对照组相比，肺结核组组病人血清 miR-361-5p、VEGF、TNF-α 水 平 较 高（均P
＜0.05），IFN-γ水平明显较低（P
＜0.05）。见表2。
表2 两组血清miR-361-5p、血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、γ-干扰素（IFN-γ）水平比较/
2.2 肺结核病人血清miR
-361
-5p 水平与VEGF、TNF
-α、IFN
-γ关系
Pearson 法相关性分析显示，肺结核病人血清 miR-361-5p 与 VEGF、TNF-α 水平呈正相关（r
=0.585、0.539，P
均＜0.05），与IFN-γ 水平呈负相关（r
=0.485，P
＜0.05）。2.3 影响肺结核的Logistic回归分析
以miR-361-5p、VEGF、TNF-α、IFN-γ水平为自变量，以肺结核是否发生为因变量，行Logistic 回归分析，结果显示miR-361-5p、VEGF、TNF-α 是影响肺结核发生的危险因素（均P
＜0.05），IFN-γ 是影响肺结核发生的保护因素（P
＜0.05）。见表3。
表3 Logistic回归分析肺结核发生的影响因素
2.4 血清miR
-361
-5p 对肺结核的诊断价值
ROC曲线显示，血清miR-361-5p 水平对肺结核发生诊断的曲线下面积（Area Under Curve，AUC）为 0.898（95%CI
：0.860～0.936），截断值为1.44，其灵敏度、特异度分别为83.82%、88.03%。见图1。
图1 血清miR-361-5p表达水平预测肺结核发生的ROC曲线
3 讨论
肺结核是一种传染性较强的肺部感染疾病，以乏力、午后低热、盗汗、咯血为主要临床症状，可导致肺癌。因此，寻找可高效诊治肺结核的指标，对提高肺结核病人生活和生存质量极具重要意义。
miRNA 是广泛分布于人体外周血的非编码小RNA，可参与调控新陈代谢、氧化应激、炎症反应等过程，与肺炎、肺结核、肺纤维化、肺癌等肺部损伤类疾病。miR-133a 在肺纤维化中表达失调，其可能参与并影响肺纤维化发展进程，miR-133a 有望成为治疗肺纤维化的靶标。miR-423-5p 在肺结核病人血清中表达上调，其可通过调节自噬小体-溶酶体融合，进而在肺结核中起关键调节作用，可作为肺结核诊断的有效指标。miR-130b 在肺癌中呈高表达，其可能参与肺癌发生发展，miR-130b 具有诊断肺癌的潜在价值。此外，Ndzi 等研究发现miR-361-5p 在肺结核中表达异常，其有望成为诊断肺结核的生物指标。miR-361-5p 在肺癌中异常表达，其可能在非小细胞肺癌进展中起一定调控作用，且可作为非小细胞肺癌预后评估指标。本研究中肺结核组病人血清miR-361-5p 水平明显高于健康对照组，提示miR-361-5p 可能在肺结核发生发展进程中起一定作用。
肺结核发展过程与免疫细胞分泌的多种炎症相关因子有关。其中，VEGF 是机体内促血管生长的重要因子，可由肺单核细胞、巨噬细胞分泌，影响结核结节、干酪样坏死，与多种炎性疾病紧密相关。TNF-α 是多功能细胞因子，可与巨噬细胞一起抵抗结核杆菌的感染，对机体释放其他抵抗结核细胞因子具有关键作用。此外，IFN-γ 可激活免疫细胞，在抗结核过程发挥重要作用，肺结核病人血清中TNF-α、VEGF 水平升高，IFN-γ 水平降低；经结核药联合利福喷丁治疗后，TNF-α、VEGF 水平降低，IFN-γ 水平升高，TNF-α、VEGF、IFN-γ 均可能参与且影响肺结核发病进展。本研究中肺结核组病人血清VEGF、TNF-α 水平均明显高于健康对照组，IFN-γ 水平明显低于健康对照组，提示炎症相关因子TNF-α、VEGF、IFN-γ可能在肺结核发病过程中起一定作用。
miR-361-5p 在冠心病中可调节VEGF 表达，这种调节方式适用于血管新生、缺血性相关疾病。本研究中肺结核病人血清miR-361-5p 与VEGF、TNF-α 水平呈正相关，与 IFN-γ 水平呈负相关，提示miR-361-5p可能与VEGF、TNF-α、IFN-γ等炎症相关因子相互作用，共同影响肺结核发生与发展。本研究显示，miR-361-5p、VEGF、TNF-α 是影响肺结核发生的危险因素，IFN-γ 是影响肺结核发生的保护因素，提示miR-361-5p、VEGF、TNF-α 水平升高、IFN-γ水平降低，均可能使肺结核患病风险升高，及时监测miR-361-5p、VEGF、TNF-α、IFN-γ 水平有利于及早诊治肺结核。进一步研究发现，血清miR-361-5p水平对肺结核发生诊断的AUC 为0.898，当血清miR-361-5p 相对表达量高于1.44 时，肺结核发病几率增加，提示血清miR-361-5p 对肺结核有较高诊断价值。
综上所述，肺结核病人血清miR-361-5p 表达上调，miR-361-5p 与炎症相关因子具有一定相关性，其可能与炎症因子共同影响肺结核疾病病变过程。本研究存在样本较少，可能引起实验出现误差，此外，本研究未比较miR-361-5p与VEGF、TNF-α、IFN-γ 及各项联合诊断肺结核的价值，后续将扩大样本比较上述各指标诊断肺结核的价值及其与肺结核类型的关系。
