微小RNA-216b-5p对骨肉瘤MG63细胞功能的影响及其与高迁移率族蛋白B1的靶向关系
2021-07-28曾胜陈佳汝张荣路鹏飞
曾胜，陈佳汝，张荣，路鹏飞
骨肉瘤是一种多发于儿童或青少年的恶性骨肿瘤，目前其预后效果并不理想，而快速的肺部转移是导致骨肉瘤高死亡的重要原因；因此，深入探讨骨肉瘤发生发展的分子机制对更精准更好的治疗骨肉瘤具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类短小的非编码RNA，可在转录后水平调控基因的表达，通过调节癌细胞的生物学行为（增殖、凋亡、侵袭等），参与多种肿瘤的病理进程，包括骨肉瘤。MiR-216b-5p是miR-216家族成员，在胰腺癌、肾癌和宫颈癌等呈现较低水平，显示出抗癌活性。然而，miR-216b-5p 在骨肉瘤中的详细功能及机制尚未完全阐明。因此，本研究自2019年1-7 月观察miR-216b-5p 在骨肉瘤MG63 细胞增殖、侵袭和凋亡中的作用与机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
Transwell 小室购于美国Corning 公司，1640 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine 3000和Trizol试剂购于美国Life technology 公司，二甲基亚砜和MTT 试剂购于美国Sigma 公司，Matrigel 基质胶购于美国 BD 公司，miR-216b-5p mimics、miR-216b-5p inhibitor 及 其 相 应 阴 性 对 照mimics-NC、inhibitor-NC 购于上海 GenePharma 公司。双荧光素酶报告基因系统检测试剂盒购于美国Invitrogen 公司，细胞凋亡检测试剂盒、逆转录试剂盒和BCA 蛋白检测试剂盒购于上海碧云天公司。兔抗人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购于美国Santa Cruz 公司。二氧化碳细胞培养箱和NanoDrop2000c 紫外分光光度计购于美国Thermo Scientific 公司，DM4000B正立显微镜购于德国Leica公司，CFX96实时荧光定量PCR仪购于美国Bio-Rad 公司，DTX880 酶标仪购于美国Beckman Coulter 公司，Tanon-6600 凝胶成像仪购于上海天能公司。1.2 细胞培养、分组与转染
人骨肉瘤细胞系MG63购于中科院上海细胞库，培养箱条件为饱和湿度、37 ℃、5%二氧化碳，培养基为RPMI-1640培养基（含100 U/mL 青-链霉素双抗和10%胎牛血清）。实验分组为 mimics-NC 组（转染 mimics-NC）、miR-216b-5p mimics组（转染miR-216b-5p mimics）、inhibitor-NC 组（转染inhibitor-NC）和miR-216b-5p inhibitor组（转染miR-216b-5p inhibitor）。在6孔细胞板中接种MG63 细胞（对数生长期），待其融合至70%以上时，遵循Lipofectamine 3000 操作说明进行各实验分组的转染。等待5 h后更换新鲜培养液，继续保持48h。收集MG63细胞进行后续测定。1.3 实时荧光定量PCR 检测miR
-216b
-5p 的表达
MG63细胞的总RNA 以Trizol法提取，浓度与纯度采用紫外分光光度计测量。参照逆转录试剂盒说明书将RNA 进行逆转录。以逆转录产物cDNA（1 μL）为模板，加入5 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix、各1μL 正反引物，补加去离子水制成10 μL PCR 反应体系。PCR 反应条件如下：（1）预变性阶段：95 ℃ 6 min；（2）循环阶段：95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环。采用2法检测MG63细胞中miR-216b-5p相对于内参U6的表达水平。1.4 MTT 法检测细胞增殖
96 孔细胞板上接种MG63 细胞（对数生长期），10个/孔，待其汇合度达70%时，按照1.2 中进行分组处理，每组设置6 个复孔。分别在转染第1、2 和 3 天以 20 μL MTT 试剂（5 g/L）孵育4 h，150μL二甲基亚砜溶解结晶，10 min后在酶标仪测量450 nm 波长处MG63 细胞的吸光度值。1.5 Transwell 小室检测细胞侵袭
24孔细胞板上接种MG63 细胞（对数生长期），10个/孔，待其汇合度达70%时，按照1.2 中进行分组并转染。48h 后，用无血清培养基将各组细胞浓度稀释为10个/毫升。将100μL 无血清培养基稀释的Matrigel 基质胶室温下对Transwell 小室（置于24 孔板内）聚碳酸酯膜进行包被。次日，将小室上室内加入200 μL 细胞液，并在小室下室内加入600 μL 含血清RPMI-1640培养基。常规培养24 h 后，棉签擦除上室内残留的MG63 细胞，下室细胞分别采用4%多聚甲醛进行固定和0.1%结晶紫进行染色。清洗晾干后，显微镜下统计每组穿膜MG63细胞数，以3个随机选取视野细胞数的均值表示细胞的侵袭能力。1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡
收集转染48 h 后的 mimics-NC 组、miR-216b-5p mimics 组、inhibitor-NC 组和miR-216b-5p inhibitor 组细胞，经磷酸缓冲液漂洗后，加入600 μL 结合缓冲液调整细胞浓度。取细胞悬液100μL（含10个细胞），加入5 μL Annexin-V-FITC 和 5μL PI，混匀后避光反应 15 min。补加上样缓冲液200 μL后，1 h内流式细胞仪检测。1.7 双荧光素报告基因实验检测miR
-216b
-5p 和HMGB1 的靶向关系
将含miR-216b-5p 互补位点的野生型（WT）HMGB1 3'UTR 片 段 克 隆 到psi-CHECK-2 荧光素酶载体上，构建HMGB1-WT，另外将 miR-216b-5p 与 HMGB1 3’UTR 结合的位点进行定点突变，将其克隆到psiCHECK-2 荧光素酶载体上，构建突变型（MUT）报告基因质粒HMGB1-MUT。将构建HMGB1-WT、HMGB1-MUT 质粒参照Lipofectamine 3000 说明书分别同 mimics-NC、miR-216b-5p mimics、inhibitor-NC和miR-216b-5p inhibitor共转染至MG63 细胞中。待转染48 h 后，胰酶消化收集各组MG63 细胞，通过双荧光素酶报告基因系统检测试剂盒检测荧光素酶活性。1.8 蛋白质印迹法（Western blotting）检测HMGB1蛋白的表达
胰酶消化收集转染48 h后的mimics-NC 组、miR-216b-5p mimics 组、inhibitor-NC组和miR-216b-5p inhibitor 组细胞，加入细胞裂解液提取MG63 细胞总蛋白后，通过BCA 法测量蛋白的浓度。将热变性后的蛋白样品（80 μg）行SDSPAEG 和转PVDF 膜。将5%脱脂奶粉中封闭1 h 后的PVDF膜于4 ℃下与HMGB1、GAPDH 一抗（均为1∶1 000 稀释）工作液孵育，12 h 后于室温与二抗（辣根过氧化酶标记的IgG；1∶2 000）工作液孵育，1 h 后经化学发光剂显影，在凝胶成像系统中扫描，分析HMGB1蛋白相对于GAPDH的表达。
2 结果
2.1 miR
-216b
-5p 在各组骨肉瘤MG63 细胞中的表达
转染miR-216b-5p mimics 后MG63 细胞中miR-216b-5p 的表达水平较mimics-NC 组明显升高［（5.36±0.54）比（1.00±0.11），F =
633.585，P
＜0.05］；而转染 miR-216b-5p inhibitor 后 miR-216b-5p 的表达水平较 inhibitor-NC 组明显降低［（0.24±0.03）比（0.96±0.08），P
＜0.05］。2.2 miR
-216b
-5p 对骨肉瘤MG63 细胞增殖的影响
从1 d 开始miR-216b-5p mimics 组细胞的增殖活力明显低于mimics-NC 组（P
＜0.05），而miR-216b-5p inhibitor组细胞的增殖活力明显高于inhibitor-NC组（P
＜0.05）。见表1。
表1 miR-216b-5p对骨肉瘤MG63细胞吸光度值比较/
2.3 miR
-216b
-5p 对骨肉瘤MG63 细胞侵袭的影响
miR-216b-5p mimics 组细胞的侵袭能力较mimics-NC 组明显降低（P
＜0.05）；而miR-216b-5p inhibitor 组细胞的侵袭能力较inhibitor-NC 组明显升高（P
＜0.05）。见表2。2.4 miR
-216b
-5p 对骨肉瘤MG63 细胞凋亡的影响
miR-216b-5p mimics 组细胞凋亡率比mimics-NC 组明显升高（P
＜0.05）；而 miR-216b-5p inhibitor组细胞凋亡率较inhibitor-NC 组明显降低（P
＜0.05）。见表2。
表2 miR-216b-5p对骨肉瘤MG63细胞侵袭和凋亡能力的比较/
2.5 miR
-216b
-5p 和HMGB1 靶向关系的验证
HMGB1 3' UTR 与miR-216b-5p 的结合位点采用Targetscan 软件预测，见表3。与相应对照相比，miR-216b-5p mimics 可使转染 HMGB1-WT 质粒的MG63细胞的荧光素酶活性降低，且miR-216b-5p inhibitor 可使转染 HMGB1-WT 质粒的 MG63 细胞的荧光素酶活性升高（P
＜0.05）；但miR-216b-5p 对转染HMGB1-MUT 质粒的MG63 细胞的荧光素酶活性无显著影响（P
＞0.05）。见表4。
表3 高迁移率族蛋白B1（HMGB1）3'UTR与miR-216b-5p互补结合位点
表4 各组可使转染HMGB1-WT质粒的MG63细胞荧光素酶活性/
2.6 miR
-216b
-5p 对骨肉瘤MG63 细胞中HMGB1蛋白的表达
与mimics-NC 组相比，miR-216b-5p mimics 组细胞中HMGB1 蛋白的表达水平明显降低［（0.31±0.03）比（0.56±0.04），P
＜0.05］；而miR-216b-5p inhibitor 组细胞中HMGB1 蛋白的表达水平比inhibitor-NC 组明显升高［（0.89±0.07）比（0.58±0.05），F=
205.212，P
＜0.05］。3 讨论
miRNAs 与骨肉瘤的发生发展有着千丝万缕的联系，miRNAs 充当促癌或抑癌基因在骨肉瘤发病进程中扮演重要角色。抑癌基因miR-216b-5p与肿瘤有关，如：Yu 等观察到 miR-216b-5p 水平在胰腺癌组织中异常降低，而miR-216b-5p 过表达可通过靶向调控TPT1抑制胰腺癌细胞增殖，诱导细胞周期停滞和细胞凋亡。董道全在41 对肾癌组织中发现miR-216b-5p 的表达水平低于正常组织的7.066 倍，而上调miR-216b-5p 可明显抑制肾癌细胞增殖与迁移，并促进细胞凋亡。此外，He 等研究发现miR-216b-5p 低表达还是Linc00518 高表达促进前列腺癌紫杉醇抗药性的重要机制。为了探讨miR-216b-5p 在骨肉瘤中的作用，本研究通过通过转染miR-216b-5p mimics和miR-216b-5p inhibitor上调和下调miR-216b-5p 表达，通过常规生物学手段检测miR-216b-5p对骨肉瘤MG63细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。结果上调miR-216b-5p 表达可抑制MG63 细胞增殖、侵袭。该结果与 Xie 等研究发现的miR-216b-5p 的表达升高是长链非编码RNA TTTY15 低表达抑制骨肉瘤MG63 细胞活力和侵袭的重要机制相吻合。此外，上调miR-216b-5p 表达还可诱导MG63细胞凋亡，而下调miR-216b-5p 表达时结果相反。这提示miR-216b-5p 是骨肉瘤的抑癌基因。
HMGB1是一种细胞内典型的非组蛋白，可通过调控DNA 修复、基因转录和细胞外信号转导等在肝癌、乳腺癌和结肠癌等多种肿瘤细胞生长和转移过程中发挥着重要作用。Lv 等研究指出，HMGB1在骨肉瘤组织和细胞中高表达，且发挥着促进肿瘤细胞增殖和迁移的作用。Meng 等和Liu等还指出，骨肉瘤中高表达的 HMGB1 还可促进癌细胞侵袭并抑制细胞凋亡。为了探讨miR-216b-5p 抑制骨肉瘤进展的分子机制，本研究将HMGB1作为研究对象。HMGB1 3’UTR 与 miR-216b-5p 存在互补的结合位点，同时miR-216b-5p mimics 可与HMGB1 3’UTR 靶向结合降低细胞的荧光素酶活性，并下调HMGB1 蛋白的表达，而miR-216b-5p inhibitor 则可呈现出相反结果。结果表明，HMGB1 是miR-216b-5p 的靶基因。该结果与 Chen 等在结直肠癌证实的HMGB1 是miR-216b-5p 的靶基因结果相吻合。提示靶向调控HMGB1 表达可能是miR-216b-5p发挥抗骨肉瘤恶性进展的重要机制之一。
综上所述，miR-216b-5p 在骨肉瘤MG63 细胞中发挥抗增殖、抗侵袭和促凋亡的作用，这可能与靶向HMGB1 有关。本研究仅从单种骨肉瘤细胞上阐述了miR-216b-5p 在骨肉瘤中的作用，miR-216b-5p在不同骨肉瘤细胞系中的作用可能有所不同，后期将从多种细胞株以及裸鼠移植瘤动物实验中加以验证，以期为miR-216b-5p 有望成为骨肉瘤的候选靶基因提供新的参考依据。
