壳聚糖-迷迭香镀冰衣对卵形鲳鲹冻藏期间品质变化影响

蓝蔚青，赵欣宇，巩涛硕，谢 晶

（上海海洋大学 1.食品学院/ 2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心/ 3.食品科学与工程国家级实验教学示范中心，上海 201306）

卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）又名金鲳、鲳鲹，为鲈形目鲹科鲳鲹属暖水性水产动物，主要生活在热带及温带沿海，其肉白色细嫩，富含脂肪，且鲜美甜口，该鱼种发展潜力巨大。

冻藏是保持卵形鲳鲹鲜度的主要方式，但长期冻藏会导致其蛋白质变性[1]、干耗[2]、脂肪氧化[3]等，使品质变劣。采用镀冰衣处理可延缓水产品在冻藏过程中的品质劣化[4]。镀冰衣是水产原料冻结后，将其置于预冷的冰衣液中，由于鱼体表面与冰衣液具有温度差，可在其体表形成冰层的保鲜方法。镀冰衣处理后可将样品与空气隔离，防止长时间贮藏的干耗与空气氧化，进一步延长其货架期[5]。其中，赵启蒙等[6]研究发现，在-18 ℃与-25 ℃冻藏鲶鱼（Silurus asotus）3 个月，同一冻藏温度镀冰衣处理可延缓鲶鱼的腐败，更好保持其鲜度。目前主要使用冰衣液对水产品体表镀层，虽然相比未镀冰衣处理，其可适当延缓水产品的品质劣变，但单一镀冰衣处理仍存在抗氧化性差、抑菌效果不足等缺点[4]，故可在冰衣液中添加具有抗菌、抗氧化活性的生物保鲜剂以提升保鲜效果。

壳聚糖（Chitosan，CS）是由(1,4)-连接的-2-氨基-脱氧-b-D-葡聚糖组成的天然阳离子多糖，是甲壳素的脱乙酰产物。由于其具有无毒、抗氧化、抗菌与抗真菌特性，还有生物降解、相容性与成膜性，可作为可食性薄膜来延长食品货架期[7]。迷迭香（Rosmarinus officinalis，RE）的叶子和花中富含抗氧化成分迷迭香酸，其可提取抗氧化剂或提炼迷迭香精油，也能作为食品调味剂使用。目前迷迭香提取物已列入GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中，可作为食品抗氧化剂[8]。此后，Choulitoudi 等[9]评估了迷迭香提取物对4 ℃冷藏的熏制鳗鱼（Anguilla anguilla）的抗氧化效果，得出迷迭香提取物可明显延缓鳗鱼片初级和次级氧化产物的形成；Shi 等[10]发现用迷迭香提取物对冷冻泥虾（Solenocera melantho）上釉后，能显著降低冷冻储存24 周期间虾的质量损失、蛋白质降解与脂质氧化。

目前冰衣在水产品保藏中已有应用，但复合镀冰衣用于水产品保鲜的研究报道尚少。基于此，本研究拟选取壳聚糖与迷迭香提取物复合镀冰衣处理卵形鲳鲹，期间通过理化（TBA 值、FR 值、pH值、TVB-N 值、TPA 值）、微生物（菌落总数）分析，结合LF-NMR 与MRI 技术，综合表征壳聚糖与迷迭香提取物复合镀冰衣对卵形鲳鲹冻藏期间品质变化影响，以期为该镀冰衣技术的应用推广提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验原料：卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）购于上海市自发渔业专业合作社，选取质量在（500±50）g，体长在（30±5）cm 的鲜活样品，并在30 min 内运至实验室。

药品试剂：壳聚糖（脱乙酰度90%，分子质量70～ 80 ku）购自上海高信化玻仪器有限公司；迷迭香提取物（水溶性提取物，食品级，纯度99%，主要成分为：迷迭香酸）购自上海维编科技有限公司；平板计数琼脂（plate count agar，PCA）购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；轻质氧化镁、磷酸缓冲液等购自国药集团化学试剂有限公司，均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

TA.XT Plus型质构仪，英国Stable Micro System公司；Alliance 2695 型高效液相色谱（High Performance Lipid Chromatography，HPLC）系统，美国Waters 公司；JX-05 拍打式无菌均质器，上海净信实业有限公司；Meso MR23-060H-I 型核磁共振成像分析仪，上海纽迈电子科技有限公司等。

1.3 方法

1.3.1原料处理 将卵形鲳鲹置于速冻机中，冻结至鱼体中心温度为-20 ℃。将样品随机分成四组，分别使用无菌水（CK）、2.0 g/L 迷迭香提取物（RE）、5.0 g/L 壳聚糖结合2.0 g/L 迷迭香提取物（CS1+RE）与15.0 g/L 壳聚糖结合2.0 g/L 迷迭香提取物（CS2+RE）进行镀冰衣处理。预冷冰衣液温度控制在2～ 6 ℃，通过浸渍将卵形鲳鲹在冰衣液中镀冰衣10～ 15 s，冰衣量保持在（10±1）%（质量分数）。样品用自封袋分装好后放入-20 ℃冰箱中冻藏5 个月，期间每月随机选取各组样品，解冻后取鱼肉进行相关指标测定。

1.3.2理化指标

1.3.2.1硫代巴比妥酸（TBA）值 参考Yu 等[11]法，稍作修改。称取5.0 g 样品置于50 mL 离心管中，随后加入25 mL 200 g/L 的TCA 溶液均质，静置1 h 后以48 000 r/min 转速离心10 min，过滤。滤液用蒸馏水定容至50 mL，取5 mL 滤液向其中加入5 mL 0.02 mol/L 的TBA 溶液后混匀，沸水浴20 min，待冷却后在532 nm 处用分光光度计测定其光密度（D）。结果以mg/kg 表示，由光密度D 和标准曲线计算TBA 值。

1.3.2.2荧光比值（Fluorescence Ratio，FR）参考石径[12]的方法并稍作修改，取5 g 鱼肉于离心管中；加入10 mL 甲醇浴5 mL 氯仿后匀浆，加5 mL氯仿冲洗，混匀后加5 mL 水，于1 500 r/min 离心10 min，过滤至离心管。在激发波长327/415 nm，发射波长393/463 nm 处进行脂质提取物所含荧光物质测定，用硫酸奎宁校标样品的荧光值。相对荧光值RF（Relative Fluorescence）由下列计算得出：

其中，F 为样品激发波长或发射波长吸收值，Fst为硫酸奎宁标样在相应激发波长或发射波长吸收值。结果用荧光比值表示：

1.3.2.3pH 值与TVB-N 值 参考GB 5009.237-2016[13]，利用pH 计测定样品在不同时期的pH 值。参考GB 5009.228—2016[14]半微量定氮法原理，使用全自动凯氏定氮仪测定样品的TVB-N 值，平行测定3 次，结果单位以mg/100 g 表示。

1.3.2.4质构分析（TPA）参考TAN 等[15]的方法进行质构分析。取20 mm×20 mm×10 mm 的鱼肉，吸除表面水分后，分别使用TA.XT Plus 型质构仪测定样品的硬度、黏性与弹性值，每个样品经历2 次压缩分析。测定条件：探头型号为P/50 平底柱状探头，测前速度为3 mm/s；测试速度和测试后返回速度均为1 mm/s；二次压缩间隔时间5 s，压缩程度50%，弛豫时间5 s。最后结果取平行测定6 次，取平均值。

1.3.2.5K 值 参考Mohan 等[16]的方法并稍作修改。在5.0 g 鱼样加入体积分数10%的预冷HClO4溶液10 mL，搅拌后均质，在4 ℃、9 000 r/min 条件下离心15 min，取上清液放入离心管中，沉淀物中加入10 mL 体积分数5%的预冷高氯酸溶液，搅拌混匀后离心，合并上清液，沉淀重复步骤2 次。上清液用10 mol/L KOH、1 mol/L 的KOH 溶液调至pH 值为6.5，静置30 min 后过滤。滤液于容量瓶中用超纯水定容，孔径0.22 μm 滤膜过滤后分装至液相进样瓶中于冷冻室中保存待测。参照Huang等[17]法计算K 值。

1.3.3菌落总数（Total viable count，TVC）值 参考GB 4789.2-2016[18]测定样品的菌落总数，平行测定3 次，结果以对数值表示。

1.3.4低场核磁共振LF-NMR 与核磁共振MRI参考Cao 等[19]的方法用核磁共振分析仪测定样品的横向弛豫时间（T2）和水分分布。MRI 采用核磁共振成像仪测定鱼肉的质子密度图谱，将样品放入核磁管中，在核磁共振成像仪中分析。最终的鱼肉质子密度图谱由8 次扫描重复累加所得，质子密度图由苏州纽迈公司软件统一映射、伪彩。

1.4 数据处理

使用OriginPro 8.5 软件绘图；采用SPSS 19.0中的单因素方差分析和Duncan 新复极差法多重比较进行统计分析，结果以Means±SD 表示。

2 结果与讨论

2.1 硫代巴比妥酸TBA 值

卵形鲳鲹在冻藏期间会发生氧化酸败，不饱和脂肪酸会氧化生成降解产物——丙二醛，其与TBA反应生成粉红色化合物。鱼肉的TBA 值与冻藏时间及温度具有相关性，数值越高，表明其脂肪氧化越严重[20]。因此，可由光密度值来判断水产品脂肪氧化程度。

由图1 可知，新鲜样品初始TBA 值为（0.33±0.04）mg/kg。随着贮藏时间的延长，各组样品的TBA 值随之升高。其中，对照组与处理组样品的TBA 值在冻藏初期的2 个月无显著差异（P＞0.05）。在冻藏2 个月后，壳聚糖与迷迭香提取物复合镀冰衣处理组样品的TBA 值增长速度减缓。到冻藏第5个月时，CK、RE、CS1+RE 与CS2+RE 处理样品的TBA 值分别增至（1.49±0.08）、（1.4±0.06）、（0.9±0.05）和（0.48±0.05）mg/kg，表明与单独使用迷迭香提取物相比，复合镀冰衣处理能较好延缓卵形鲳鲹贮藏期间的脂肪氧化速率，延长其货架期，且复合镀冰衣作用效果与壳聚糖浓度正相关。这可能是因为壳聚糖可清除DPPH•自由基，且具有较好的抑菌活性，可抑制样品贮藏期间的脂质氧化[21]。

图1 壳聚糖-迷迭香提取物复合镀冰衣对卵形鲳鲹冻藏期间TBA 值变化影响Fig.1 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on TBA changes in Trachinotus ovatus during frozen storage

2.2 荧光比FR 值

通过荧光化合物的形成，可评估存在于卵形鲳鲹鱼肉中的初级与次级脂质氧化产物及亲核分子间的相互作用[22]。不同类型镀冰衣处理对卵形鲳鲹冻藏期间的荧光比值变化影响如图2 所示。

由图2 可知，样品的初始FR 值为1。随着贮藏时间的延长，各组样品的FR 值相应升高。从贮藏的第1 个月起，对照组样品的FR 值已超过2，而复合镀冰衣处理组样品的FR 值仍低于1.5。其中，CS2+RE 复合镀冰衣处理组样品的FR 值最低。可见，CS2+RE 复合镀冰衣处理可更好抑制样品冻藏期间脂肪氧化，这与TBA 值的结果一致。脂肪氧化是一个复杂的过程，会产生很多中间产物，由上述结果可表明，CS2+RE 复合镀冰衣处理能够抑制二级（TBA）和三级（荧光化合物）脂质氧化化合物的形成[22]。

图2 壳聚糖-迷迭香提取物复合镀冰衣对卵形鲳鲹冻藏期间荧光比值变化影响Fig.2 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on the changes of fluorescence ratio in Trachinotus ovatus during frozen storage

2.3 菌落总数

菌落总数是评价水产品品质的重要指标，不同镀冰衣方式对卵形鲳鲹冻藏期间TVC 值变化影响如图3 所示。

由图3 可知，新鲜样品的TVC 值为1.70±0.14。随着贮藏时间的延长，各组样品的TVC 值随之升高。与CK、RE 镀冰衣组相比，壳聚糖结合迷迭香提取物镀冰衣对微生物的抑制效果较好，其中又以CS2+RE 镀冰衣组作用效果最佳，其在贮藏第5个月时的TVC 值为2.99±0.08。可能是因为壳聚糖能通过影响菌体细胞膜通透性、破坏其细胞壁，微生物的结构遭到破坏，生命活动紊乱而达到抑菌目的；迷迭香提取物中的酚类和萜类物质破坏了菌体细胞膜，抑制其生长繁殖[23-24]。

图3 壳聚糖-迷迭香提取物复合镀冰衣对卵形鲳鲹冻藏期间TVC 变化影响Fig.3 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on TVC changes in Trachinotus ovatus during frozen storage

2.4 pH 值与挥发性盐基氮TVB-N 值

由图4a 可见，样品初始pH 值在6.97±0.03，该值在冻藏前2 个月呈下降趋势并达到最低点，后期逐渐升高。这是由于水产品在贮藏前期，糖类物质通过无氧氧化产生乳酸，各组样品的pH 值随之下降。后期，随着贮藏时间的延长，水产品体内微生物分解产生含氮类化合物，pH 值相应升高，这与前人研究结果一致[25]。与迷迭香提取物镀冰衣组样品相比，复合镀冰衣组样品的pH 值始终较低，但两组复合处理组差异不显著（P＞0.05）。由此表明，壳聚糖与迷迭香提取物的加入能通过抑制微生物生长，从而减少含氮类化合物分解，减缓样品贮藏后期pH 值的上升，抑制其腐败，这与TVC 的结果一致。该研究结果与谭明堂等[26]一致。

总挥发性盐基氮是微生物和酶作用下的蛋白质降解产物，可用于评估海产品新鲜度[27]。根据SC/T 3101-2010 鲜冻大黄鱼标准显示，TVB-N 值＜18 mg/100 g 为一级鲜度，18 mg/100 g≤TVB-N 值＜0 mg/100 g 为二级鲜度[28]。不同镀冰衣处理组样品冻藏期间的TVB-N 值变化如图4b 所示。新鲜样品的TVB-N 值为（9.50±0.23）mg/100 g，各组样品在冻藏前两个月的TVB-N 值变化不显著（P＞0.05）。随着冻藏时间的延长，对照组与处理组样品RE、CS1+RE 与CS2+RE 处理样品的TVB-N 值分别增至（18.37±0.27）、（16.82±0.24）、（13.89±0.36）和（13.57±0.05）mg/100 g。与对照组相比，复合镀冰衣处理样品在冻藏期间TVB-N 值处于一级鲜度。以CS2+RE 处理样品的TVB-N 值最低，表明壳聚糖与迷迭香提取物能通过抑制微生物繁殖，从而减缓TVB-N 值的上升，且作用效果与壳聚糖浓度正相关，这与TVC 的分析结果一致。Sun 等[21]研究发现壳聚糖与苹果多酚复合处理冷藏草鱼（Ctenopharyngodon idellus）片，可抑制其贮藏期间TVB-N 值上升。

图4 壳聚糖-迷迭香提取物复合镀冰衣对卵形鲳鲹冻藏期间pH 值与TVB-N 值变化影响Fig.4 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on pH and TVB-N value in Trachinotus ovatus during frozen storage

2.5 质构分析

质构是评价水产品品质变化的重要指标，其主要包括硬度、黏性与弹性等[29]。由表1 所示，对照组样品的硬度与弹性值随着贮藏时间的延长逐渐下降，黏性值随之升高。可能因为鱼肉在微生物与酶的作用，其肌肉结构受到破坏，硬度与弹性降低，使可溶性固形物随着汁液流失过程渗出，导致黏性增加[30]。与对照组样品相比，单一与复合镀冰衣处理组样品的硬度值与弹性值降幅更缓，黏性值处于低水平。其中，复合镀冰衣处理效果优于单一迷迭香处理组，可能是壳聚糖与迷迭香具有良好的抗氧化与抗菌作用，起到保护屏障作用，保持其良好的质构特性。

表1 壳聚糖-迷迭香提取物复合镀冰衣对卵形鲳鲹冻藏期间质构变化影响Table 1 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on TPA changes in Trachinotus ovatus during frozen storage

2.6 K 值

K 值可客观反映海水鱼类的新鲜度，作为其在贮藏阶段的主要鲜度指标[31]。当K 值＜20%为优良，20%≤K 值＜60%为中等，K 值＞60%为腐败[32]。

由图5 可知，新鲜样品的K 值为（14.1±0.2）%，表明其品质较好。随着贮藏时间的延长，各组样品的K 值在贮藏第1 个月后显著升高。其中，单一与复合镀冰衣处理组样品的K 值上升幅度缓于对照组。冻藏5 个月时，CK、RE、CS1+RE 与CS2+RE处理样品的K 值分别为（43.8±0.1）%、（36.5±0.6）%、（36.0±1.5）%、（33.0±0.5）%。表明单一镀冰衣与复合镀冰衣处理能延缓样品冻藏期间ATP 的降解速度，保持其良好品质，尤其以CS2 +RE 处理效果更佳，该结果与谢晶等[33]研究一致。这可能是因为壳聚糖与迷迭香提取物复合镀冰衣处理，降低了样品冻藏期间的核苷酸酶活性，抑制其ATP 降解。

图5 壳聚糖-迷迭香提取物复合镀冰衣对卵形鲳鲹冻藏期间K 值变化影响Fig.5 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on the changes of K value in Trachinotus ovatus during frozen storage

2.7 低场核磁共振LF-NMR 与核磁共振MRI

LF-NMR 通过测定样品中质子横向弛豫时间（T2）的衰减来分析其含水量。表2 显示了卵形鲳鲹样品在冻藏期间的水分迁移变化。

由表2 可知，样品在贮藏初期时不易流动水较多，随着贮藏时间延长，水分状态逐渐向自由水转变。即水分由胞内结合水与不易流动水转化为胞外自由流动水[34]。不易流动水含量的降低，表明样品的保水性下降。单一与复合镀冰衣处理组样品的不易流动水含量虽有所下降，但其保水性仍优于对照组。其中，以壳聚糖结合迷迭香提取物镀冰衣的作用效果最佳，且保水性与壳聚糖浓度成正比。

表2 壳聚糖-迷迭香提取物复合镀冰衣对卵形鲳鲹冻藏期间水分迁移变化影响Table 2 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on the changes of water migration in Trachinotus ovatus during frozen storage %

一般情况下，MRI 图像中的亮度越强（由加权像转化的伪彩图中越趋红色），即此部位的水质子信号越强，该部位的水分含量就越高。不同类型镀冰衣处理对卵形鲳鲹冻藏期间核磁成像变化影响如图6 所示。

图6 壳聚糖-迷迭香提取物复合镀冰衣对卵形鲳鲹冻藏期间MRI 变化影响Fig.6 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on the changes of magnetic resonance imaging (MRI) in Trachinotus ovatus during frozen storage

由图6 可知，卵形鲳鲹样品随着冻藏时间的延长，其伪彩图的亮度变弱，品质相应下降。其中，CK 组样品的含水量下降最快，其在第5 个月时的伪彩图亮度最低。而CS2+RE 复合镀冰衣组样品在冻藏期间始终保持高亮。可见，样品经复合镀冰衣处理后，能较好保持样品贮藏期间的含水量，使卵形鲳鲹冻藏期间的综合品质相对最佳。

2.8 相关性分析

壳聚糖-迷迭香复合镀冰衣对卵形鲳鲹冻藏期间的pH 值、TBA 值、TVB-N 值、K 值与TVC 值的相关性分析如表3 所示。由表3 可知，样品贮藏期间的TBA 值与TVB-N 值显著相关（P＜0.05），与K 值、TVC 值极显著相关(P＜0.01)。这是因为样品随着冻藏时间的延长，其中的蛋白质等含氮类物质易在微生物的作用下降解，对其质构特性产生影响，使其鲜度下降。

表3 壳聚糖-迷迭香提取物复合镀冰衣对卵形鲳鲹冻藏期间作用影响的指标间相关性分析Table 3 Correlation analysis of chitosan and rosemary extract composite glazing on Trachinotus ovatus during frozen storage

3 结论

壳聚糖结合迷迭香提取物镀冰衣处理，能有效抑制卵形鲳鲹冻藏期间的脂肪氧化以及微生物繁殖，延缓其pH 值、TVB-N 值、K 值的上升，保持良好的硬度、黏性与弹性值。同时，还能减缓样品贮藏期间的水分流失，提升其综合品质。其中以15.0 g/L 壳聚糖与2.0 g/L 迷迭香复合镀冰衣处理效果最佳。因此，壳聚糖与迷迭香复合镀冰衣可用于卵形鲳鲹的冻藏保鲜，该研究结果为海产品贮藏保鲜研究提供一定理论参考。