菊黄东方鲀精巢醇提物（AETT）的抗疲劳作用与毒理安全性

刘淑集，廖登远，李水根，苏永昌，苏 捷，刘智禹

（1.福建省水产研究所//国家海水鱼类加工技术研发分中心（厦门）//福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室//福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建 厦门，361013；2.福建海洋职业技术学校，福建 福州，350000）

疲劳是现代社会一种常见的亚健康状态，长期处于疲劳状态，会使机体发生内分泌紊乱，抵抗力和免疫力逐渐下降，引起早衰，甚至会引发一些潜在的慢性疾病急性发作，出现器质性病变[1-2]。因此，缓解疲劳，改善人体亚健康状态受到人们越来越多的重视，研究开发具有抗疲劳功能食品或营养食品极具市场前景。如蔡亚伟等[3]研究发现牡蛎（Ostrea gigas）肉提取物可以提高小鼠的抗疲劳能力和耐缺氧能力，增强小鼠的免疫力；刘娴[4]制备的青石斑（Chromileptes altivelis）鱼肉多肽能降低小鼠血清尿素氮的含量，提高小鼠肝糖原含量，具有较好的抗疲劳作用；董陈颍等[5]研究的鲑（Salmo sala）蛋白（肽）能显著延长小鼠力竭游泳时间，降低血清尿素氮含量，具有明显的抗疲劳作用。

河鲀是一种高蛋白、低脂肪的鱼类，其精巢具有养精固气、滋阴补阳的功效[6]，在日本民间有用河鲀精巢泡酒饮用的风俗。但河鲀精巢泡酒发挥保健功效的成分及其是否有毒性等至今均未有研究报道。菊黄东方鲀（Takifugu flavidus）属于鲀科东方属，属于温带近海底层鱼类，是我国福建省养殖的主要河鲀品种之一。养殖的菊黄东方鲀的鱼肉、鱼皮、鱼骨、精巢均是无毒的，河豚毒素的测定结果低于限值，属于D 级（无毒）[7]。因此，本研究以食用酒精浸泡菊黄东方鲀精巢制备的醇提物［alcohol extract of testis from T.flavidus（AETT）］为原料，通过小鼠实验测定小鼠的负重游泳时间和血清尿素氮、血清乳酸、肝糖原含量的变化，研究其抗疲劳功效及毒理安全性，以期为河鲀精巢抗疲劳保健酒开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

小白鼠（北京华阜康生物科技有限公司，无特定病原体SPF 级别）；菊黄东方鲀精巢（福建省漳州市漳浦县佛昙镇）；乳酸、肝糖原、血清尿素氮等试剂盒（南京建成生物工程有限公司）；牛磺酸（阿拉丁试剂有限公司）；生理盐水（国药集团），香菇多糖（远慕生物科技有限公司）

1.2 仪器

HH-6 数显恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司）；酶标仪（TECAN 集团有限公司）；离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；真空冷冻干燥机（德国CHRIST）

1.3 方法

1.3.1菊黄东方鲀精巢醇提物的制备 将菊黄东方鲀进行剖杀，收集精巢组织，清水洗净，冻干，粉碎保存。用52 °食用酒精，按照料液质量（g）体积（mL）比1∶25、水浴温度50 ℃的条件提取4.5 h，离心，取上清液，减压蒸馏浓缩，冷冻干燥得到菊黄东方鲀精巢醇提物（得率约为24.2%）。

1.3.2动物实验

1.3.2.1动物分组 取60 只小鼠，体质量为（20±2）g，动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005。将小鼠随机分为6 组，包括菊黄东方鲀精巢醇提物饲喂低、中、高剂量组［50、100、200 mg/（kg•d）］、精巢原样组［100 mg/(kg•d)］、阳性对照组［香菇多糖50 mg/（kg•d）］和空白对照组（生理盐水），每组10 只小鼠，雌雄各半；分组后25 ℃适应环境饲养7 d，光暗12 h∶12 h 交替；每天灌胃1 次，灌胃剂量见分组。灌胃前小鼠称重记录，连续28 d。此实验期间，小鼠自由摄食及饮水。

1.3.2.2负重游泳实验 末次给药30 min 后，将各组小鼠取出，尾部绑定该只小鼠体质量5%的自制负重物；在游泳箱中放入适量水，水深约40 cm，水温保持（25±1）℃；将要进行实验的小鼠充分打湿毛发，防止毛发间的空气对实验产生影响；将小鼠放入游泳箱游泳。每只水箱一次放入5 只小鼠。如有小鼠趴在游泳箱边缘部位休息，则用玻璃棒驱离，使其保持运动状态，记录小鼠从游泳开始至力竭的时间（以小鼠身体完全没入水中且持续10 s 后为判断标准），为小鼠力竭游泳时间。

1.3.2.3血清尿素氮和肝糖原含量的测定 末次给药30 min 后，将小鼠毛发充分打湿，置于游泳箱中不负重游泳90 min，取出，擦拭掉水，让小鼠休息60 min；小鼠摘取眼球取血，常温放置2 h 后，1 575 g 离心10 min 分离血清；解剖小鼠，分离得到小鼠肝脏，生理盐水漂洗后，吸干水分，精确称量100 mg，利用尿素氮和肝糖原试剂盒说明书测定血清尿素氮和肝糖原的含量。

1.3.2.4血乳酸含量测定 末次给药30 min 后，将各组小鼠取出，尾静脉采血20 μL；在游泳箱中保持25 ℃水温，不负重游泳10 min，尾静脉取血20 μL；小鼠休息20 min 后，再次尾静脉取血20 μL；利用全血乳酸检测试剂盒说明书分别检测3 次血中乳酸的含量，计算全血乳酸曲线下面积。公式为：全血乳酸曲线下面积=5 ×（游泳前血乳酸值+3 ×游泳后0 min 血乳酸值+2 × 游泳后休息20 min 的血乳酸值）。

1.3.2.5毒理实验 采取 GB 15193.3-2014[8]和Zhao 等[9]的方法进行毒理实验。每组实验雌雄小鼠各10 只，级别为ICR 级别，分开饲养。适应一周后，小鼠禁食6 h，但饮水不受限制。之后将菊黄东方鲀精巢醇提物按剂量15 g/kg 给小鼠灌胃。小鼠灌胃完成后，观察其状态，一共观察14 d，并解剖小鼠，观察小鼠内脏[10]。

1.4 数据处理

采用SPSS17.0 软件对实验结果进行统计学处理，组间进行多重比较，LSD 和Duncan’s multiple range test 判断组间样本的显著差异；每组小鼠10只，实验进行3 次重复，取平均值，表示为

2 结果与分析

2.1 菊黄东方鲀精巢醇提物对小鼠体质量的影响

由表1 可以看出，空白组、菊黄东方鲀精巢醇提物高、中、低剂量剂量组、原样组和阳性组小鼠的体质量随着时间的延长逐渐增长。灌胃饲养相同时间时，空白组、菊黄东方鲀精巢醇提物低、中、高剂量组、原样组和阳性组，各组组间小鼠体质量的差异不显著（P >0.05），说明菊黄东方鲀精巢醇提物饲喂对小鼠的体质量没有显著影响（P >0.05）。

表1 菊黄东方鲀精巢醇提物对小鼠体质量的影响Table 1 Effects of AETT on weight of mice g

2.2 菊黄东方鲀精巢醇提物对小鼠负重游泳时间的影响

灌胃菊黄东方鲀精巢醇提物饲养28 d 后，各组小鼠的负重游泳时间如图1 所示。高剂量组小鼠负重游泳时间为45.35 min，是空白对照组小鼠负重游泳时间的2.24 倍，极显著地延长了小鼠的负重游泳时间（P <0.01），提示灌胃高剂量AETT 使小鼠体力明显增加；中、低剂量组和原样组小鼠负重游泳时间分别是空白组的1.41、1.09 倍和1.23 倍，在一定程度上延长了小鼠负重游泳时间，与空白组无显著差异（P >0.05）。实验结果说明菊黄东方鲀精巢醇提物能够延长小鼠负重游泳的时间，且呈现剂量效应。

图1 菊黄东方鲀精巢醇提物对小鼠负重游泳时间的影响Fig.1 Effects of AETT on weight-bearing swimming time in mice

2.3 菊黄东方鲀精巢醇提物对小鼠血清乳酸含量的影响

如图2 所示，喂养28 d 后，各组小鼠无负重游泳1 h 后，高、中剂量组和阳性对照组的血乳酸含量分别比空白组减少了20.0%、12.4%和19.6%，具有显著差异（P＜0.05），低剂量组和原样组的血乳酸含量与空白组的血乳酸含量相近。说明经过酒精浸提的菊黄东方鲀精巢产物可以有效地清除或延缓小鼠体内乳酸堆积，随着剂量的增加，对血乳酸的清除作用逐渐明显，呈现一定的量效关系。

图2 菊黄东方鲀精巢醇提物对小鼠血清乳酸含量的影响Fig.2 Effect of AETT on serum lactic acid content in mice

2.4 菊黄东方鲀精巢醇提物对小鼠血清尿素氮含量的影响

各组小鼠喂养28 d 后，血清尿素氮变化情况如图3 所示。高、中、低剂量组、阳性组和原样组分别比空白组降低了37.30%、22.0%、13.7%、25.4%和10.1%，高剂量组血清尿素氮含量与空白组比具有极显著差异（P＜0.01），低剂量组和原样组则差异不明显。菊黄东方鲀精巢经醇提取后，在一定剂量范围内，不同剂量组给药，能够减轻血清中尿素氮的含量，且随着剂量增加，作用越显著，提示菊黄东方鲀精巢醇提物可以提高肾脏清除尿素氮的能力，具有一定的抗疲劳功效。

图3 菊黄东方鲀精巢醇提物对小鼠血清尿素氮的影响Fig.3 Effect of AETT on serum urea nitrogen content in mice

2.5 菊黄东方鲀精巢醇提物急性毒理实验

以15 g/kg 剂量给小鼠灌胃菊黄东方鲀精巢醇提物，并持续观察14 d，结果见表2。小鼠无死亡现象，体质量变化正常。小鼠的摄食、毛色、大小便、精神状态等行为活动均未发现异常。小鼠眼、鼻腔、口腔未发现分泌异常物质。观察后将小鼠进行解剖，肉眼观察内脏器官未见异常。该结果表明菊黄东方鲀精巢醇提物对小鼠无毒。

表2 菊黄东方鲀精巢醇提物急性毒性试验观察记录Table 2 Observation records of AETT in acute toxicity test

图4 菊黄东方鲀精巢醇提物对小鼠肝糖原含量的影响Fig.4 Effect of AETT on hepatic glycogen content in mice

3 讨论

疲劳是一种复杂的生理生化过程，机体的生理过程会因为运动耐力下降不能维持一定的运动强度。因此，常常采用负重游泳试验考察小鼠的运动耐力反映机体抗疲劳能力的大小[5]。机体在运动过程中首先会消耗体内的肌酸磷酸（CP）和三磷酸苷（ATP），分解糖原变成苯丙酸，最后变成乳酸，在此期间还会产生ATP，其又可作为能源[11]。而在较长时间的运动后，当机体可利用的糖原耗竭时，机体不能通过糖、脂肪代谢获得能量时，蛋白质和氨基酸就会进入分解代谢[4]，同时核苷酸的分解代谢也会加强，导致脱氨基生成氨[10]，致使血清中尿素氮含量迅速增加，使得机体对负荷的适应能力变差，肌体就显示出疲劳的现象[12-13]。大量运动也会使骨骼肌细胞内的主要代谢失去平衡，使机体处于缺氧状态，也加快糖酵解速度，导致大量的乳酸产生，引起疲劳[10]。运动耐力下降引起运动性疲劳，负重游泳时间的长短是运动耐力的直接体现[14-15]，也可反映抗疲劳的能力。本研究结果显示，菊黄东方鲀精巢醇提物可增加小鼠力竭游泳时间；Yang等[16]研究表明黑豆籽醇提物能够延长小鼠的游泳时间，呈现剂量依赖性，具有抗疲劳潜力。

糖与耐力运动的关系非常密切，糖原均会迅速分解产生ATP，维持机体血糖平衡。运动时肌肉会消耗肌糖原，引起血糖降低，工作能力下降，诱发疲劳[17-18]。因此，糖原含量高低是机体运动耐受力的重要标志，可用于测定疲劳程度[19-21]。剧烈运动时，机体相对缺氧，使有氧肌肉活动转变为无氧代谢，糖酵解加快，乳酸大量堆积，使肌肉中H+浓度升高，pH 值下降，引起机体延迟性酸痛，产生疲劳感觉。因此，血乳酸水平可以反映有氧代谢能力、疲劳的产生和消除速度，也是评价机体有氧代谢能力和疲劳程度的敏感指标[22-23]。尿素氮是蛋白质的代谢产物。当机体长时间运动使正常的能量代谢平衡遭到破坏后，并且随着机体运动负荷的适应性降低及蛋白质和含氮化合物的分解代谢作用加强，血清尿素氮增加就越明显[24-25]。血清尿素氮含量的变化也是评价抗疲劳效果的重要指标。当菊黄东方鲀精巢醇提物被吸收进入体内有助于肌糖原的积累，增加肝糖原的储备量，减少血乳酸和血清尿素氮的产生量，说明菊黄东方鲀精巢醇提物具有增加机体糖原储备，增强机体对运动负荷耐受能力的功效。这与王勇刚等[12]研究的鱼精多肽在抗疲劳方面的作用结果相吻合。Hu 等[26]也证实核桃分心木（Diaphragma juglandis）的醇提物能够延长小鼠的负重游泳时间，减少血清尿素氮含量，提高乳酸脱氢酶水平和肝糖原含量，具有抗疲劳和抗氧化功效。对于菊黄东方鲀精巢醇提物的使用剂量来说，呈现剂量效正相关趋势，随着剂量增加，药效也跟着明显。

根据抗疲劳保健食品的功能评价程序和检验方法，若1 项以上（含1 项）运动实验和2 项以上（含2 项）生化指标为阳性，即可判断该受试物具有抗疲劳作用[21]。菊黄东方鲀精巢醇提物动物试验中，1 项运动试验和3 项生化指标的结果为阳性，可以判断其具有抗疲劳效果。经过急性毒理实验确认菊黄东方鲀精巢醇提物对小鼠无毒副作用，是安全的。因此，采用河豚鱼精巢泡酒开发保健酒具有抗疲劳功效，具有高值化开发应用前景。