牡蛎酶解产物对小鼠学习记忆的影响

2021-07-25朱国萍章超桦曹文红卢虹玉秦小明高加龙郑惠娜

广东海洋大学学报 2021年4期

朱国萍，章超桦，曹文红，卢虹玉，秦小明，高加龙，郑惠娜

（广东海洋大学食品科技学院//国家贝类加工技术研发分中心（湛江）//广东省水产品加工与安全重点实验室//广东省海洋生物制品工程实验室//水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东湛江 524088）

近年研究发现，饮食对学习记忆的调节具有十分重要的作用[1]，饮食与大脑变化间存在关联[2-3]，因此利用富含功效活性营养成分的食物作为饮食来源是一种具有潜在改善学习记忆功效作用的干预手段。许多陆生植物提取物已被证实具有显著改善学习记忆的功效，核桃蛋白酶解物[4]、火麻仁提取液[5]可有效改善D-半乳糖诱导的学习记忆损伤小鼠对空间和有害刺激的学习记忆能力；枸杞子提取物[6]可显著改善阿尔茨海默病（AD）小鼠的学习和记忆缺陷；日本当药（Swertia japonica）[7]、金针菇（Flammulina velutipes）多糖[8]对东莨营碱诱导记忆功能损伤小鼠的空间学习和记忆能力均有显著的修复作用。相对于陆生植物来源产物，来源于海洋的水产品因其生活环境的差异，使其含有独特的天然活性物质，呈现多样的功效活性。近年的研究发现部分水产品的酶解产物也具有良好的改善学习记忆的作用。如海参（Cucumaria frondose）[9]和灯笼鱼（Benthosema pterotum）[10]的酶解产物可改善D-半乳糖引起的早衰小鼠学习记忆障碍；凤尾鱼（Coilia mystus）酶解产物可改善东莨菪碱诱导的小鼠记忆损伤[11]，马氏珠母贝（Pinctada martensii）酶解蛋白粉可改善自然衰老导致的斑马鱼学习记忆能力衰退[12]。利用海洋来源的水产品进行学习记忆功效作用的研究已成为当前研究热点。

牡蛎富含蛋白质、糖原、牛磺酸、锌、硒等营养物质，素有“根之源”“海洋牛奶”等美称[13]，是研究学习记忆改善功效作用富有潜力的原料。Wang 等[14]发现大连湾牡蛎（Crassostrea talienwhanensis）的酶解产物可缩短正常小鼠空间探索实验中总游泳路程，提高小鼠目标象限时间，也能延长小鼠在黑白箱实验中白箱停留时间；课题组前期发现香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）酶解产物对正常小鼠及D-半乳糖诱导记忆损伤小鼠学习记忆均有一定改善作用[15-16]。前期实验结果均证实牡蛎酶解产物具有改善学习记忆的功效作用，但课题组前期使用的行为学评价方法不够系统，仅采用单一的行为学实验方法对小鼠行为学进行观察，也没有对牡蛎酶解产物灌胃剂量进行筛选，其所含的与该生物活性相关性较大的营养成分含量尚不清楚。因此，本研究采用跳台实验、避暗实验、水迷宫实验相结合，利用高、中、低三剂量牡蛎酶解产物灌胃小鼠，综合考察牡蛎酶解产物提高正常小鼠学习记忆的能力，明确灌胃剂量及功效作用，同时测定其营养成分，了解其相关营养成分的含量，以期为未来利用牡蛎开发改善学习记忆的保健功效食品奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）购自广东省湛江市东风市场；BALB/c 小鼠、C57BL/6 小鼠（6～8 周龄，雄性，无特性病原体SPF 级），许可证号SCXK（粤）2013-0002，购自广东省医学实验动物中心；中性酶（5×104U/g），食品级，购自广西南宁庞博生物工程有限公司；苯酚，AR，购自广州化学试剂厂；葡萄糖，AR，购自国药集团上海化学试剂有限公司；吡拉西坦片，购自东北制药集团沈阳第一制药有限公司。

1.2 仪器与设备

U410 超低温冰箱：英国 New Brunswick Scientific；T18 高速分散机：德国IKA 公司；V-1100V-WB 旋转蒸发仪：上海埃朗仪器有限公司；MW800 VHP 微波消解系统：加拿大Aurora 公司；Thermo MKIIM6 原子吸收分光光度计：美国Thermo 公司；Flyde-maz 跳台记录仪：广州飞迪公司；PAT-8 避暗实验视频分析系统：成都泰盟软件有限公司；JL Behv-MWMG 水迷宫视频分析系统：上海吉量软件科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1牡蛎酶解产物的制备牡蛎自然解冻后，组织均浆，然后按质量（mg）体积（mL）比1∶3 加水，调节pH 至7.0，按质量分数2%加入中性蛋白酶，50 ℃下酶解3 h，100 ℃下灭酶10 min，以10 000 r/min 离心20 min 取上清液，真空浓缩后冷冻干燥，-80 ℃ 超低温冰箱保存备用。

1.3.2氨基酸组成测定氨基酸组成采用氨基酸

1.3.5跳台实验[17]根据动物在封闭空间中，会在边缘与角落里活动的生活特性而设计，在铜栅四处探索的小动物遭受电击后会立即跳上平台进行躲避，经过多次电击后的动物，会产生短暂的记忆。跳台实验分记忆巩固与记忆消退实验。

记忆获得训练：末次给药后2 d 将小鼠单独放到跳台仪反应箱中（平台上、下均让动物熟悉），适应3 min 后，将动物放在铜栅上，立即通入36 V的交流电，动物受电击后会立刻跳回平台躲避伤害，训练1 次后，将小鼠放在反应箱平台上，记录5 min 内小鼠第一次跳下平台的时间，即为潜伏期。并记录跳下平台的错误次数。

记忆巩固实验：末次给药3 d 后进行重复实验，将小鼠放在反应箱平台上，记录第一次跳下平台的时间，即为潜伏期，记录3 min 内受电击次数、受电击的动物总数，计算出现错误反应的动物百分率分析仪按 GB5009.124-2016 测定。

1.3.3无机元素的测定无机元素含量的测定采用火焰原子吸收法按GB/T 15337-2008 测定。

1.3.4动物分组、给药及饲养 BALB/c 小鼠用于跳台实验及避暗实验，C57BL/6 小鼠用于水迷宫实验；动物饲养在专用动物房，5 只/箱群养，采用12 h 昼∶12 h 夜的照明方式；期间动物按实验要求喂给相应颗粒饲料，并且动物自由进食饮水。

给药方法：动物分组后，受试样品LG、MG、HG 组按20 mL/kg 的灌胃剂量以相应浓度的受试样品液，PG 组需灌胃吡拉西坦阳性药液，CT 组需灌胃纯净水，各组灌胃1 次/日。实验开始前，跳台实验、避暗实验和水迷宫实验均灌胃30 d，但水迷宫实验开始后训练期间要求继续给药，故水迷宫实验共计灌胃40 d。具体动物实验剂量及分组见表1。（即受电击动物总数占该组动物总数的百分率）。

表1 剂量设计与分组Table 1 Dose design and grouping

记忆消退实验：末次给药8 d 后进行一次记忆消退实验，方法同记忆巩固实验。

1.3.6避暗实验[18]利用动物趋暗避明生活习性而设计的装置，喜欢呆在暗室的小鼠在遭受电击后回到明室，当小鼠遭受多次电击后会产生短暂的记忆。避暗实验同样分记忆巩固与记忆消退实验。

记忆获得训练：末次给药24 h 后开始训练，小鼠放入避暗仪中适应3 min，后背向避暗仪洞口，放入明室，同时启动计时器，暗室电压调为3 档，小鼠穿过洞口进入暗室受到电击时，计时器自动停止，此时间即为潜伏期。训练5 min，记录5 min内电击次数。

记忆巩固实验：于记忆获得训练后24 h，小鼠不需要适应3 min，直接按记忆获得训练作实验，记录潜伏期、5 min 内的电击次数、进入暗室的动物数，计算出现错误反应的百分率（即进入暗室动物总数占该组动物总数的百分率）。

记忆消除实验：记忆巩固实验结束5 d 后，进行记忆消退实验，方法同记忆巩固实验。

1.3.7水迷宫实验水迷宫实验可将实验动物的学习障碍与感觉、运动缺陷等方面分开，减少其对空间学习记忆过程检测的干扰[19-20]，能较准确地反映动物的空间参考记忆和工作记忆能力[21-22]。Morris 水迷宫是神经生物学领域研究中最广泛应用的迷宫实验，包括定位航行和空间探索实验。

定位航行实验：实验前1 d，小鼠自由游泳90 s适应环境，期间引导小鼠站上站台5 s，次日开始实验。实验时，站台设置在第二象限，水迷宫水面高出站台0.5 cm，水温控制在（23±2）℃，并沿泳池壁贴好黑色参照物，从1 个象限中将小鼠面向池壁放入水中，计时90 s，让小鼠寻找站台并在站台上停留3 s，仪器自动记录小鼠寻找并爬上站台的游泳路线图、总路程、所需时间（逃避潜伏期）。若小鼠90 s 内不能找到平台，则由实验人员引导其到达站台，并在站台上逗留3 s，潜伏期记为90 s。每天4 个象限均训练一次，每次间隔约10 min，训练1 d 后，进行3 d 的定位航行实验，期间无需引导上站台，每天小鼠放入象限的顺序应不相同。四个象限的平均成绩为最终的成绩。训练期间继续给药。

空间探索实验：定位航行实验结束5 d 后，将水下站台撤除，水温控制在（23±2）℃，并沿泳池壁贴好参照物，按定位航行实验的方法，分别从四个象限将动物面朝池壁放入水中，记录90 s 内动物的游泳路线、路程、在原站台处穿越的次数，在原站台所在象限逗留的时间。四个象限的平均成绩作为最终的成绩。

1.4 数据统计分析

所有数据均采用平均值±标准差表示，并应用SPSS 19.0 软件进行统计及分析；计量资料的数据方差齐，或数据经转换后的方差齐，则采用单因素的方差分析（ANOVA）；若数据经转换后方差仍不齐，采用秩和检验的方法进行统计分析。显著性水平为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 牡蛎酶解产物氨基酸的含量

牡蛎经水解后获得较高含量的总氨基酸及部分游离氨基酸，氨基酸的含量如表2 所示。18 种水解氨基酸中谷氨酸的含量最高，其次为天冬氨酸，分别占总氨基酸的质量分数为15.7%、9.68%；游离氨基酸中则以苏氨酸占比最高。牡蛎酶解产物中牛磺酸质量分数较高，达2.85%，其含量远高于鱼类及甲壳类，是黄鲷（3.47 mg/g）及日本对虾（1.99 mg/g）[23]所含牛磺酸的8 倍和14 倍。

表2 牡蛎酶解产物氨基酸组成及质量分数（干基）Table 2 Composition of amino acids of enzymatic hydrolysis from oyster (dry matter basis) %

2.2 牡蛎酶解产物无机元素的含量

牡蛎酶解产物无机元素的含量如表3 所示，测定的8 种无机元素中Na、K 元素的质量分数远高于其他元素，分别为1 414 mg/100g 和1 045 mg/100g，Se 含量在测定的8 种无机元素中最低。Zn 质量分数高达175 mg/100g。

表3 牡蛎酶解产物无机元素质量分数(干基)Table 3 Composition of inorganic elements of enzymatic hydrolysis from oyster (dry matter biasis) %

2.3 基于跳台实验分析牡蛎酶解产物对小鼠学习记忆的影响

巩固实验结果（表4）显示各组小鼠均没有错误跳下平台遭受铜栅电击，潜伏期均为180 s（图1_A），显示各组小鼠的学习能力不存在差异性（P >0.05）。消退实验CT 组出现4 只小鼠跳下平台，样品组LG、MG、HG 组分别有3、3、2 只小鼠跳下平台，错误动物数及犯错次数有所减少，但差异不显著（P >0.05），而PG 组没有出现小鼠错误跳下平台的情况；相较于CT 组，喂食吡拉西坦可显著延长小鼠的潜伏期（P <0.05），喂食牡蛎酶解产物

图1 跳台实验逃生潜伏期Fig.1 Escape latency in step down test

表4 跳台实验错误动物数及错误次数Table 4 Number of errors of animal in step down test

2.4 基于避暗实验分析牡蛎酶解产物对小鼠学习记忆的影响

巩固实验五组均有小鼠进入通电的暗室，各组错误动物数及潜伏期差异不明显，小鼠间学习能力无差别（P >0.05）（表5、图2_A）。记忆消退实验结果发现，与CT 组相比，喂食吡拉西坦及牡蛎酶解产物均可减少小鼠进入暗室的数量（表5），延长小鼠进入暗室的潜伏期（P <0.05）（图2_B），具有提高小鼠学习记忆能力的功效作用，喂食吡拉西坦全组小鼠没有进入暗室。三个剂量样品组错误动物数与空白对照组相比，分别减少4、3、5 只，潜伏期为（214±44）、（228±37）、（287±13），分别延长21、35、94 s（P <0.05）。高剂量牡蛎酶解产物延长小鼠的潜伏期接近吡拉西坦，具有相当于吡拉西坦提高小鼠的学习记忆能力的功效作用。

表5 避暗实验错误动物数及错误次数Table 5 Number of errors of animal in through test

图2 避暗实验逃生潜伏期Fig.2 Escape latency in through test

2.5 基于水迷宫实验分析牡蛎酶解产物对小鼠学习记忆的影响

定位航行实验中，随着测试时间的延长，各组小鼠上台前的路程及潜伏期均呈现逐渐缩短的趋势，至3 d，HG、LG 组及PG 组小鼠上台前路程及潜伏期均显著低于1 d（P <0.05）。与CT 组相比，2 d 时HG 组上台前的路程及潜伏期也分别缩短1105 mm（P <0.05）、5.3 s（P <0.05），远低于PG组；至3 d，LG 组上台前的路程也比CT 组显著缩短1 431 mm（P <0.05）（图3）。

图3 定位航行逃生路程及潜伏期Fig.3 Escape distance and lantency in place navigation trail

空间探索实验发现，牡蛎酶解产物三剂量组小鼠在目标象限所停留时间及穿越平台次数均呈现一定的浓度依赖性，HG 组小鼠目标象限停留时间及穿越平台次数均最高，其穿越平台次数显著高于CT 组（P <0.05），与PG 组相当，但各组小鼠目标象限所停留时间不存在明显差异（P >0.05）（图4）。

图4 空间探索实验中目标象限时间比例及穿越平台次数Fig.4 Percentage of target time and crossing times in spatial probe test

2.6 牡蛎酶解产物对实验小鼠体质量的影响

实验过程中各组小鼠体质量变化见表6-8。各组小鼠体质量均呈现增长趋势，且逐渐增加，不同处理组间小鼠体质量增长无显著差异（P >0.05），说明牡蛎酶解产物对实验小鼠没有毒副作用。

表6 跳台实验各组小鼠体质量Table 6 Weight of mice in step down test g

表7 避暗实验各组小鼠体质量Table 7 Weight of mice in step through test g

表8 水迷宫实验各组小鼠体质量Table 8 Weight of mice in Morris water maze test g

3 讨论

水产品酶解产物改善学习记忆的功效作用报道研究中，一些来源于水产品的活性肽[21]、多糖[21]、酶解产物[9-11]及酶解蛋白粉[12]均呈现出良好的学习记忆改善作用。这些来源于海洋的水产品蛋白质、矿物质含量丰富，多糖生物活性强。蛋白质经酶解发生降解释放生物活性肽及氨基酸，氨基酸在中枢神经系统发育过程中具有广泛的生理病理作用。部分氨基酸通过提高空间记忆作用[24]、神经细胞的增殖作用[25]，海马区的长时程增强[26]，干扰神经细胞的凋亡通路[27-28]，促进神经细胞的分化、生成，提高认知功能[29]，降低缺氧环境对人类认知功能的损害[30]等方式参与多方面正常脑功能，包括认知、记忆及学习。无机元素K、Ca2+、Mg2+等离子能够调节神经递质的释放[31-33]。给予小鼠长期饮用含Mg2+的水，可增强其脑源性神经营养因子（BDNF）的表达，能增强大鼠的空间学习记及工作忆能力[33]；锌是许多中枢神经系统内突触的共同传递因子且参与突触的可塑性[34-35]，是神经元转运过程中必不可少的金属元素[36]。富含牛磺酸、锌等无机元素且氨基酸种类齐全的牡蛎酶解产物具有改善学习记忆功效的潜在价值。

跳台实验、避暗实验、迷宫实验等行为学实验近年已成为神经药理学、神经生理学、神经心理学、老年病学等的常用研究手段[37-38]。跳台实验和避暗实验均属于被动回避反应实验，联合运用可以更准确地反应药物对动物长时期记忆的作用。牡蛎酶解产物能显著延长避暗消退实验小鼠的潜伏期，降低错误动物数，且高剂量样品延长小鼠的潜伏期接近吡拉西坦。吡拉西坦是目前临床上用于治疗退行性神经性疾病的有效药物，牡蛎酶解产物延长避暗消退实验小鼠的潜伏期与吡拉西坦的效果相当，说明牡蛎酶解产物具有相当于吡拉西坦提高学习记忆能力的功效作用。牡蛎酶解产物也能一定程度延长跳台消退实验的潜伏期，但差异不显著，可能与样品剂量较低有关。水迷宫实验属主动动物反应实验，实验小鼠在喂食牡蛎酶解产物后缩短了逃避潜伏期及上台前路程（上台前潜伏期及路程），并提高了穿越平台的次数，证明牡蛎酶解产物能够提高小鼠空间记忆和工作记忆能力，使小鼠能清晰辨识出迷宫原平台位置，从而采取更直线的游泳路径，快速找到水下平台逃生。

与林海生等[14]仅采用单一剂量进行水迷宫实验探究牡蛎酶解产物改善小鼠学习记忆的功效作用不同，本研究采用高、中、低三剂量进行灌胃剂量的筛选，结合跳台、避暗及水迷宫进行综合评价。在跳台实验、避暗实验和水迷宫实验中，牡蛎酶解产物改善小鼠学习记忆的功效作用均呈现出剂量依赖性，小鼠在跳台实验及避暗实验的逃生潜伏期均随着灌胃剂量的提高而延长，而水迷宫实验中定位航行逃生潜伏期及逃生路程随着灌胃剂量的提高而缩短，其穿越平台次数随着灌胃剂量的提高而提高。高、中、低三个灌胃剂量对小鼠的学习记忆均有一定的改善作用，但高剂量组改善作用最好。对灌胃剂量的筛选有利于选择合适剂量的牡蛎酶解产物，使其发挥最优的功效作用。

利用被动与主动实验相结合也已成为动物行为学实验行之有效的评价方法。Gong 等[39]在研究莲蓬原花青素对D-半乳糖引起的早衰小鼠认知功能障碍的改善作用时采用Y-迷宫和跳台实验相结合进行评价；Su 等[11]采用Morris 水迷宫和跳台实验评价凤尾鱼酶解产物及其美拉德反应物改善东莨胆碱引起的小鼠记忆损伤；Jeon 等[40]采用避暗实验和Y-迷宫研究齐墩果酸对东莨菪碱引起的大鼠认知功能障碍的改善作用。通过四项行为实验（跳台实验、避暗实验、穿梭箱实验及水迷宫实验）中任二项实验结果阳性来判定一种受试样品具有辅助改善功能，本研究中牡蛎酶解产物可显著延长小鼠进入避暗箱的潜伏期（避暗实验阳性），也显著缩短小鼠定位航行上台前路程及潜伏期，提高小鼠穿越平台的次数（水迷宫实验阳性），从而可以判定牡蛎酶解产物具有提高小鼠学习记忆能力的功效作用。