流式细胞术在贝类血细胞研究中的应用进展

2021-07-24张秀霞王冬梅李军涛张泽龙冼健安

水产学杂志 2021年3期

张秀霞，王冬梅，李军涛，张泽龙，冼健安,2

（1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室，海南海口 571101；2.中国热带农业科学院海南热带农业资源研究院，海南海口 571101）

流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）是20 世纪70 年代发展起来的快速测定细胞物理和化学性质的技术。它以单个细胞为检测单位，具有快速、灵敏、客观、检测量大并可同时检测多个指标等优点，在临床医学领域应用十分普遍。贝类是重要的水产经济动物和环境监测的重要指示生物，FCM较早地引入到贝类研究中。血细胞在贝类的细胞免疫、体液免疫以及生理代谢中发挥重要作用，但一直以来，血细胞的研究主要依赖显微观察和生化方法，技术手段的缺乏和落后制约了研究的深度。引入FCM为贝类血细胞学研究提供了很好的检测平台，推动了贝类血细胞学研究的发展。本文综述近年来FCM在贝类血细胞研究中的应用，可为FCM在贝类及其他水产动物中的进一步应用提供参考。

1 FCM在贝类血细胞分类中的应用

血细胞在贝类免疫中起至关重要的作用[1]，而血细胞的准确分类是进一步研究其功能的前提。前向角散射光（FSC）反映细胞大小，侧向角散射光（SSC）反映细胞内颗粒复杂程度，是流式细胞术区分不同类群细胞的主要参数。传统贝类血细胞分类方法主要是显微观察细胞的大小和内含颗粒的状况，因此，FCM 十分适用于贝类血细胞的分类研究。

早在1988 年就开始尝试用FCM 进行贝类血细胞分类，但研究结果的差异较大[2,3]。2001 年开始陆续有进一步的应用研究[4]，而我国则在2005 年才有文献报道[5]，其应用情况见表1。贝类血细胞的分类一直分歧很大，至今仍没有统一。应用FCM研究的结果也有一定差异，但总体看来，大部分双壳贝类的血细胞可分为三类，部分研究结果只是命名不同；关于鲍类的研究较少，均认为只区分为浆样细胞和透明细胞两类[6,7]，与显微观察的研究[8]以及对杂色鲍Haliotis diversicolor 血细胞的研究结果[9]差异较大，其原因可能是技术操作的把握程度以及数据分析的准确性存在差异。

表1 流式细胞术在贝类血细胞分类中的应用Tab.1 Application of flow cytometry in shellfish haemocyte classification

2 FCM 在贝类血细胞基础功能研究中的应用

不同类型的血细胞在贝类生理和免疫过程中的作用不同。FCM是细胞水平上的分析技术，应用这项技术为研究不同类型血细胞的功能提供了方便。

2.1 血细胞组成比例与血细胞总数（Total haemocyte count,THC）

不同类型血细胞的功能不同，血细胞的组成比例可在一定程度上反映机体的生理和免疫状态。许秀芹等[17]研究了酵母聚糖和甘氨酸锌两种饲料免疫添加剂对栉孔扇贝Chlamys farreri 血细胞组成比例的影响。结果显示，注射刺激后其透明细胞的比例增加，颗粒细胞的比例减少。栉孔扇贝注射球状病毒感染后，血细胞中透明细胞比例显著上升，大颗粒细胞比例显著下降[31]。

THC 是常用的免疫指标，一般认为THC 的下降反映了机体免疫力的下降。Lambert 等[32]比较了不同地域及不同家系太平洋牡蛎Crassostrea gigas的细胞免疫状态。结果发现，夏季耐受力较强的牡蛎家系具有更高的THC，生长地域也影响牡蛎的THC。本文认为食物源和繁殖条件可能是主要影响因素。

2.2 活性氧含量与呼吸爆发活力

细胞在吞噬过程中，伴随产生大量活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的过程称为呼吸爆发。这些活性氧是细胞毒氧化剂，包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）和羟自由基[·OH]等，在杀灭和消化病原微生物的免疫防御中起十分重要的作用[33]。2',7'-二氢二氯荧光黄双乙酸钠（DCFH-DA）是最为常用的一种荧光探针，但对于它的检测对象，还具有一定的争议。有的研究认为，它主要被H2O2所氧化[11,14,34]，有的研究认为所有种类的ROS 与之都有反应。有的则认为它反映的是ROS 和活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）的总量[7,32]。

Lambert 等[14]建立了应用DCFH-DA 作为荧光探针测定太平洋牡蛎血细胞呼吸爆发活力的FCM方法，并发现佛波酯（PMA）不影响血细胞的呼吸爆发活力；酵母聚糖可显著诱导产生ROS，主要体现于颗粒细胞上；而抗凝剂会抑制ROS 的产生。Lambert 等研究发现，不同家系和地域的太平洋牡蛎的血细胞ROS 水平不同，夏季耐受力较强的牡蛎家系ROS 水平较低[32]。Goedken 等[1]发现：PMA 刺激可显著提高美洲牡蛎C.virginica 颗粒细胞和中间型细胞的ROS 含量，而对透明细胞没有显著影响，即前两种细胞具有较强的呼吸爆发活力。Wang等[24]以DCFH-DA 探针分析了翡翠贻贝Perna viridis的ROS 含量，发现颗粒细胞的ROS 含量显著高于透明细胞；应用DHR123 作为O2-特异性探针的测定显示：颗粒细胞的O2-含量也显著高于透明细胞。Donaghy 等[15]对近江牡蛎C.ariakensis 的研究结果显示：颗粒细胞中非诱导性ROS 含量最高，透明细胞次之，浆样细胞最少。

2.3 吞噬活性

应用流式细胞术测定细胞的吞噬活性时，一般用表面结合了羧酸基团的聚苯乙烯荧光微球（Carboxylate-modified fluorescent microspheres）作为被吞噬物，最常用的是直径为1 μm 和2 μm 的黄绿色微球[7,35]。石芳芳等[36]筛选和比较了各种缓冲体系对扇贝血细胞吞噬活性的影响，结果显示以过滤海水作为缓冲液时血细胞的吞噬活性最高。海湾扇贝Argopecten irradians[37]血细胞的吞噬率显著高于栉孔扇贝[36]。李进寿等研究了不同含量荧光微球对杂色鲍H.diversicolor 血细胞的吞噬率的影响，认为当荧光微球含量为血细胞含量的6.82 倍时较为合适。研究还发现，杂色鲍经低盐度胁迫后，血细胞的吞噬率显著下降。翡翠贻贝颗粒细胞吞噬率为40.84%，显著高于透明细胞的4.50%[24]。近江牡蛎Crassostrea ariakensis 颗粒细胞的吞噬率为41.2%，显著高于透明细胞的22.6%[15]。美洲牡蛎C.virginica 血细胞中，颗粒细胞的吞噬活力最强，中间型细胞次之，透明细胞吞噬活力最低[11]。

2.4 溶酶体数量与非特异性酯酶活性

溶酶体是胞内含有众多水解酶的重要细胞器，为细胞内的溶解或消化消化器官，可以杀死和降解病原体，起到免疫防御作用。翡翠贻贝颗粒细胞中溶酶体的数量多于透明细胞[24]。皱纹盘鲍Haliotis discus discus 血细胞的溶酶体数量较为均一；根据血细胞中溶酶体数量，角蝾螺Turbo cornutus 可区分三个亚群[7]。

酯酶是溶酶体酶类之一，是机体清除病原体、异物和坏死细胞的重要工具之一。以二乙酸荧光素（FDA）为探针测定酯酶活性。翡翠贻贝颗粒细胞的酯酶活性显著高于透明细胞，这与溶酶体数量的结果相吻合[24]。除酯酶以外，通过相应的试剂盒还可用FCM 测定胞内的氨肽酶（aminopeptidase）和过氧化物酶（peroxidase）等的活性[35,38]。

3 FCM在贝类病理学研究中的应用

血细胞免疫功能研究主要通过注射和离体刺激两种方式进行处理，再分析血细胞各项参数的变化，以探讨血细胞在病原体防御过程中的作用。给太平洋牡蛎注射感染弧菌Vibrio aestuarianus 后，THC 先升高后恢复至对照组水平，这是机体对抗病原体感染的首要细胞响应。新的血细胞可能有两种来源：一是组织中血细胞被调动进入血淋巴中；二是造血组织的造血作用。感染的牡蛎血细胞的吞噬活性和粘合能力显著下降，表明该病原体通过抑制血细胞的吞噬活性和粘合能力来躲避宿主的细胞免疫；弧菌感染还使颗粒细胞和透明细胞的ROS 含量均显著升高，氧化代谢过程的失衡使机体产生氧化胁迫，这可能是发病机理之一[39]。栉孔扇贝经球状病毒注射感染后，大颗粒细胞比例显著下降，可能与组织损伤和炎症反应过程中大颗粒细胞的脱颗粒作用有关；注射病毒也导致血细胞死亡率显著上升，对免疫功能有一定的抑制作用[31]。胞内的原生动物寄生虫Bonamia ostreae 与其宿主欧洲扁牡蛎O.edulis 的血细胞进行体外孵育，导致血细胞的非特异性酯酶活性和ROS 含量显著下降，但对血细胞的死亡率和吞噬活力没有显著影响[40]。

4 FCM 在贝类生态毒理学研究中的应用

4.1 重金属

流式细胞术在贝类生态毒理学研究中应用广泛，现已研究了对重金属、有机污染物、杀虫剂、有害藻类等的细胞毒性，以及其他水体环境胁迫因子的胁迫机制。Brousseau 等[41]分析了几种重金属离子对砂海螂Mya arenaria 离体血细胞吞噬活性的影响。结果显示：对吞噬活性的抑制程度由强至弱依次为：ZnCl2＜CdCl2＜AgNO3＜HgCl2＜CH3HgCl；除Ag-NO3外，其他重金属离子在10-9mol/L 和10-8mol/L的低浓度时可刺激血细胞的吞噬活性。Sauve 等[42]研究了重金属对多种海洋和淡水贝类的毒性，结果显示：不同物种对不同的重金属具有敏感性，评估环境生态风险时应充分考虑物种间的差异。Gagnaire 等[38]研究了Cd 和Hg 对太平洋牡蛎血细胞活性和免疫功能的影响，发现在实验条件下Cd 对血细胞的影响不显著，Hg 显著抑制血细胞活性，提高氨基肽酶阳性细胞的比例，抑制酚氧化酶活性，Hg对双壳类的免疫功能更具威胁。Mottin 等[43]研究表明：高浓度Zn（1 000 μmol/L）抑制了鲍Haliotis tuberculata 离体血细胞的免疫功能和ROS 的产生，但提高了非特异性酯酶活性。Foster 等[44]比较研究了离体和活体状态下，Cu 对美洲牡蛎血细胞凋亡的影响，结果发现：离体状态下，Cu 诱导血细胞发生凋亡，但活体实验中Cu 反而抑制了血细胞凋亡，这可能是两种胁迫方式的生物利用度不同。Cd 和苯并芘胁迫7 d 后，文蛤M.meretrix 血细胞的死亡率和活性氧水平上升，吞噬功能下降，显著降低了文蛤血细胞的功能和免疫力[45]。

4.2 其他污染物

持久性有机污染物具有持久性和高毒性而受到高度重视。Gagnaire 等[46]将太平洋牡蛎血细胞分别暴露于23 种环境污染物中，包括多环芳烃（PAH）、多氯联苯（PCB）和杀虫剂，结果PAH 导致血细胞的溶酶体数量和酯酶活性下降，颗粒细胞的比例上升，但细胞死亡率下降；PCB77 抑制溶酶体数量，对其他指标没有影响；杀虫剂中对氧磷抑制溶酶体数量和酯酶活性，诱导产生ROS。Bouilly 等[47]研究发现，太平洋牡蛎暴露于除草剂敌草隆中11周后，血细胞的死亡率、颗粒细胞比例、吞噬活性、活性氧含量和溶酶体数量均上升。纳米材料作为新型的环境污染物已引起高度关注，其对生物体的毒性也不容忽视。Canesi 等[48]研究了纳米碳对贻贝Mytilus galloprovincialis 的免疫毒性，结果显示：经45 min 孵育胁迫后，10 μg/mL 纳米碳导致血细胞的线粒体数量减少，而5 μg/mL 纳米碳导致线粒体膜电位下降。

4.3 有毒藻类

水体中，尤其是发生水华时，有害藻类产生的毒素影响贝类的免疫功能，甚至导致死亡。近年来，用FCM 研究有害藻类对贝类血细胞毒性的报道很多[49]。Hégaret 等[50]发现，微小原甲藻Prorocentrum minimum 对血细胞有免疫刺激作用，而用的其他藻则抑制血细胞免疫功能，包括降低其吞噬活性、活性氧含量和粘附能力，以及导致死亡率上升。

4.4 其他环境因子

水温、盐度、溶氧和pH 等环境条件也影响贝类生存和免疫功能。Chen 等[51]分别将栉孔扇贝从17℃转移至11℃，从23℃转移至28℃72 h。结果显示，28℃升温胁迫导致扇贝血细胞吞噬活性下降，ROS含量上升，而11℃降温胁迫对细胞活性无显著的影响，表明栉孔扇贝对低温的耐受性更强。Donaghy 和Volety[25]研究了温度胁迫对翡翠贻贝离体血细胞的影响。结果显示，10℃对血细胞造成胁迫影响，抑制了其吞噬活性，提高了ROS 含量。Wang 等研究低氧和高温[52]、低氧和低盐[53]联合作用对翡翠贻贝血细胞死亡率、吞噬活性、非特异性酯酶活性、ROS 含量以及溶酶体数量的影响。曲凌云等[54]建立了应用FCM测定栉孔扇贝血细胞HSP70（热休克蛋白70）表达量变化的方法，测定了高温刺激下栉孔扇贝血细胞HSP70 表达量变化。结果显示：高温诱导了血细胞HSP70 表达量的上升，在诱导7 h 时最高[55]。杜俊鹏等[56]采用碘化丙啶（PI）/罗丹明123 双染的方法，研究了不同盐度胁迫对葡萄牙牡蛎Crassostrea angulata 精子质膜完整性和线粒体活性的影响。结果显示，盐度胁迫先损伤精子质膜，后伤害线粒体活性；10 和15 低盐胁迫对精子损伤严重，精子受精率和卵裂率显著降低。Jauzein 等[57]将光芒长文蛤Macrocallista nimbosa 从盐度30 转移至18 的水体中7 d 后，血细胞吞噬活力显著下降，死亡率升高。Andreyeva 等[28]研究显示：24 h 的缺氧胁迫导致紫贻贝M.galloprovincialis 的无颗粒细胞数量下降，而颗粒细胞数量升高，但对血细胞死亡率没有显著影响；ROS 含量在无颗粒细胞中升高，而在颗粒细胞中下降。Parrino 等[58]比较了西西里岛两个栖息区紫贻贝种群的血细胞免疫与结构特征，发现两个种群的血细胞免疫特性存在一定的差异，可能是两个栖息地的水环境参数的差异所导。Barjhoux 等[59]用Hoechst33342、PI 和黄绿色荧光微球荧光探针建立了斑马纹贻贝Dreissena polymorpha 细胞毒性和血细胞吞噬活性的分析方法，用于评估化学或环境毒性。