缺血性脑卒中患者外周血中miR-488分子标志物实验研究

张钦政，李 琪，闫本纯，马润瑶，马思琦，任晓庆，闫海润

(1.牡丹江医学院；2.牡丹江医学院附属红旗医院检验科；3.牡丹江医学院附属红旗医院泌尿外科，黑龙江 牡丹江 157011)

缺血性脑卒中(Ischemic stroke，IS)目前严重危害着人类健康，目前尚无可靠的IS生物标志物。有学者研究发现部分蛋白标志物与IS的发生发展存在联系，血清淀粉样蛋白A(SAA)、缺血修饰蛋白(IMA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)等蛋白可参与IS的生理病理过程[1]。但是，IS患者之间存在异质性，因此上述蛋白标志物作为IS的诊断标志物仍需探讨。近来有学者研究发现，miR-128在IS患者外周血血清的表达水平明显高于健康对照组，在IS发病后出现昏迷症状的患者外周血血清中miR-146a表达水平明显低于健康对照组[2-3]。miR-488在其他疾病中具有调节功能，过表达的miR-488可抑制宫颈癌细胞的周期进展，降低宫颈癌细胞的增殖和迁移能力[4]。miR-488在IS患者外周血中的表达水平变化少见报道，本研究旨在探讨miR-488在IS患者血清中表达水平的变化，以及是否可作为IS的诊断指标。

1 材料与方法

1.1 一般资料选择2020年8月至2021年2月间于我院神经内科住院治疗的IS患者60例作为病例组，根据发病时间分为：3 d病例组(30例)和7 d组病例(30例)，所有纳入病例组患者均经影像学确诊为IS的患者；选择同期来我院进行常规体检的健康体检者30例作为对照组。

病例组纳入标准：(1)符合2018年中国急性缺血性脑卒中诊治指南[5]；(2)经颅脑CT和(或)MRI检查确诊患者；(3)首次发病，既往无脑卒中病史。排除标准：(1)除IS以外的其他脑血管病；(2)肝、肾功能不全患者，心脑血管疾病患者，急性或慢性炎症患者，癌症或肿瘤患者；(3)近期存在外伤或行外科手术患者。查阅病历和体检者信息，记录所有受试者年龄、性别、血压、血糖、血脂、吸烟史等。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 TRIpure Total RNA Extraction Reagent(ELK Biotechnology)；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix(ELK Biotechnology)；台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；冷冻离心机(湖南湘仪仪器)；制冰机(常熟市雪科电器有限公司)；PCR仪(杭州博日科技)；荧光定量PCR仪(Life technologies)；超净工作台(苏净安泰)。

1.2.2 收集血清样本 于清晨采用普通生化管收集所有受测者空腹外周血5 mL，常温下4000 r/min离心10 min，转移上层血清至无菌无酶的离心管中，置于-80 ℃冰箱保存，备用。

1.2.3 血清miRNA的测定 解冻血清并取250 μL于无菌无酶管中，加入1 mL TRIpure，混匀，静置5 min，加入250 μL三氯甲烷，充分混匀，冰上静置5 min。将混合液4 ℃，10000 g，离心10 min。于超净工作台中小心吸取上清500 μL于1.5 mL EP管中，加入等体积4 ℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20 ℃静置15 min。将溶液4 ℃，10000 g，离心10 min，小心倒掉液体，加入1 mL 4 ℃预冷的75 %乙醇，颠倒数次，清洗RNA沉淀，4 ℃，10000 g，5 min离心，倒掉液体，于超净工作台中干燥数分钟，将乙醇充分挥发干净，加入100 μL RNase-Free Water，充分溶解RNA，根据ELK Biotechnology试剂盒步骤进行miR-488表达量测定。PCR反应阈值循环数(Ct)值通过StepOneTMReal-Time PCR仪获得，以U6为内参，采用2-△△CT计算各样本miR-488的相对表达量。每个反应重复三次。

1.3 统计学分析使用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料用“均数±标准差”表示。采用单因素方差分析LSD法进行组间比较及两两比较，计数资料采用卡方检验进行组间比较。病例组和对照组所得血清miRNA结果以内参U6校正，采用2-△△Ct计算miRNA相对表达量。P<0.05，差异具有统计学意义。ROC曲线用于miRNA在IS诊断价值中的优劣。

2 结果

2.1 临床资料分析病例组与健康对照组在年龄、性别、糖尿病、吸烟、高血压、高血脂等方面差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组研究对象的基本资料

2.2 血清miR-488表达水平病例组血清miR-488相对表达量与对照组相对表达量差异具有统计学意义(P<0.01)。3 d病例组血清miR-488相对表达量高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；7 d病例组血清miR-488相对表达量为分别高于对照组和3 d病例组，差异均具有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 各组血清中miR-488相对表达量

2.3 ROC曲线分析结果通过ROC曲线对miR-488作为IS诊断标志物的效率进行评估，结果显示，miR-488的AUC为0.839，敏感度和特异度分别为85%和70%，采用约登指数确定其截断值为2.175，见图1。

图1 IS患者血清miR-488的ROC曲线

3 讨论

近年来研究发现，miRNA与多种疾病的发生发展和诊断方面存在联系[6]，在IS的生理病理机制中扮演重要角色。在IS外周血中miRNA表达谱存在明显变化，并与炎症、细胞凋亡、预后和诊断等存在重要联系[7-9]，因此部分学者认为，miRNA甚至可能成为IS的治疗新靶点[10]。miRNA分子可通过血脑屏障，脑组织miRNAs水平与血清miRNAs水平变化一致[11]，检测血清中miRNAs表达水平可进一步反应IS时大脑中miRNAs的变化。IS是常见的卒中类型，本文所研究的病例组和对照组在高血压、高血脂、糖尿病、吸烟等方面不存在统计学差异，与先前的报道存在差异[12]，可能与本文所选择的样本含量较少有关。本研究重点在于探讨miR-488对于IS的诊断价值，未将miR-488与IS的严重程度、患者预后及复发纳入研究，在今后的研究中，将着重研究这些方面，对于IS的诊断、预测预后和复发具有重要价值。

IS发生后，不同时间段的miRNA表达谱存在差异，同一miRNA在不同时间段表达水平也存在差异。本文根据发病后时间分为3 d病例组和7 d病例组，与对照组相比，3 d病例组血清miR-488相对表达量高于对照组(P<0.01)，7 d病例组血清中miR-488相对表达量高于对照组和3 d病例组(P<0.01)。本文研究结果与Sepramaniam[13]研究所发现的miR-488在IS患者外周血中表达水平上升一致，并较之前的研究将病例组划分更加精确。ROC曲线分析结果所示，外周血血清中miR-488对IS进行诊断时，尽管敏感度(85%)、特异度(70%)相对不高，但仍具有一定的诊断价值。miRNA可以调节多种mRNA以实现基因调节功能，而现阶段，国内外学者并未对miR-488在IS发生发展过程的机制进行深入研究，仅Zhou，L[14]等对miR-488-3p通过VPS4B蛋白可以IS的神经细胞死亡进行了研究，因此，在以后的研究中将深入探讨miR-488所调节的靶基因及通路，以期为治疗IS提供新思路。本文提到部分学者研究认为蛋白标志物或许可作为IS诊断的标志物，但将miRNA与蛋白标志物进行联合检测的研究较少，若寻找miR-488所调节的蛋白标志物，进行联合检测或许对于IS的诊断价值更高。

综上所述，本文研究表明，miR-488分子标志物具有作为IS早期诊断标志物的潜能。