基于网络药理学方法探讨香附治疗肝癌的作用机制*

张慕垚，谭晓慧，王振飞，耿刚

1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010100；2.内蒙古肿瘤医院，内蒙古 呼和浩特 010020；3.内蒙古自治区中医医院，内蒙古 呼和浩特 010010

肝癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。2020年美国癌症统计报告显示，美国男性和女性的肝癌及肝内胆管癌死亡率分别为6%和4%［1］，2018年中国男性肝癌诊断率为12.4%、死亡率为15.2%。由于病毒感染引起的肝癌得到了一定的防控［2］，但转移率和死亡率仍然较高，严重威胁着人民的健康。中医药在抗肿瘤方面积累了丰富的临床经验，中药以多途径、多靶点抑制肝癌的发生发展，在临床治疗中优势突出。

香附，别名莎草、香头草、回头青、雀头香、雷公头、三棱草根等，是莎草科植物莎草的干燥根茎，主产于我国浙江、山东、福建、湖南、安徽一带。味辛、微苦微甘、平，归肝、脾和三焦经，具有疏肝解郁、理气宽中、调经止痛的功效［3］，可用于治疗肝郁气滞、胁肋胀痛、脘腹疼痛、月经不调、黄疸、疝气等疾病。药理研究显示，该药具有抗肿瘤作用［4－5］，但目前对抗肿瘤活性成分和作用的分子机制知之甚少。本研究采用网络药理学的方法分析香附抗肝癌作用的活性成分，寻找活性成分的作用靶点及通路，为该药的深度开发及抗肝癌临床应用提供理论依据。

1 方法

1.1 香附活性成分的获取在TCMSP数据库检索到香附的全部活性成分，根据生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%和类药性（durgliness，DL）＞0.18的条件筛选出有效活性成分。下载药物相关的所有靶点，用Perl软件将上述有效成分相关的靶点在所有靶点中筛出，通过Uniprot数据库将已筛选出的靶点名转换为靶点Symbol，标准化处理以便后续操作。

1.2 肝癌靶点的获取在GeneCards数据库（https：／／www.genecards.org／）中以“Liver cancer”为关键词进行检索，导出所有肝癌相关靶标，以Relevance score＞1的条件进行筛选，得到与肝癌关联性较大的靶标。在OMIM数据库（https：／／www.omim.org／）中Gene Map内以“Liver cancer”为关键词进行检索，导出所有肝癌相关靶标。将两个数据库检索得到的靶标汇总，摘取Symbol备用。

1.3 确定香附－肝癌的共同靶点应用韦恩图在线 工 具（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）将1.1和1.2获取的香附与肝癌的靶点Symbol取交集，得到香附与肝癌的共同靶点，绘制韦恩图，保存交集文件。

1.4 香附－活性成分－肝癌－靶点关系网络构建用Cytoscape 3.7.0软件构建香附治疗肝癌的关系网络图。打开Cytoscape导入前期准备好的相关文件，绘制网络图，调整图片颜色格式大小等参数，导出图片，得到“香附－活性成分－肝癌－靶点”的关系网络。

1.5 PPI蛋白互作网络构建及柱状图绘制运用STRING（https：／／string－db.org／）在线分析软件，找到Multiple proteins，在List Of Names中输入香附与肝癌的靶点Symbol交集文件，物种选择人（即Homo Sapiens），点击search、continue，默认最小的score为0.4，得到PPI蛋白互作网络图。用R语言计算节点连线与连接基因的数目，取数目最多的前30个基因绘制柱状图。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析用R语言香附中有效活性成分治疗肝癌的靶基因进行GO生物过程富集分析和KEGG通路富集分析，设置P＜0.05，Q＜0.05，物种为人，分析结果以柱形图和气泡图的形式予以展示。

2 结果

2.1 香附活性成分及作用靶点按OB＞30%和DL＞0.18的条件筛选出的香附活性成分18个，见表1。香附所有活性成分的相关治疗靶点1029个，用perl找出18个成分所作用的靶点496个，将这些靶点名在Uniprot数据库中转化为Symbol，得到231个靶点Symbol。

表1 香附的活性成分

2.2 香附－肝癌靶点香附活性成分作用靶点231个，删除重复，剩余108个。由GeneCards、OMIM数据库检索整合肝癌靶点15 392个，去除重复靶点，剩余14 248个。将香附活性成分作用靶点与肝癌靶点取交集得到香附－肝癌靶点105个，见图1。

图1 香附靶点与肝癌靶点韦恩图

2.3 香附－活性成分－肝癌－靶点关系网络构建运用Cytoscape 3.7.0软件构建香附治疗肝癌的“香附－活性成分－肝癌－靶点”关系网络图，见图2。红色菱形表示肝癌，蓝色椭圆形代表香附，黄色四边形代表活性成分，绿色三角形表示靶点。该网络共包括有效成分16个，节点105个，成分靶点间共存在333条相互作用关系。通过香附治疗肝癌关系网络可视化，可知香附的一种有效成分可作用于多个肝癌的靶点，同一个肝癌的靶点也可受多个有效成分调控。

图2 香附－活性成分－肝癌－靶点关系网络图

2.4 PPI蛋白互作网络及柱状图该PPI网络包含节点105个，边937条，平均节点度17.8，平均局部聚类系数0.584，PPI富集P＜1.0e－16。网络节点代表了蛋白质，其大小和颜色的深浅代表度值大小，节点度值越大代表节点在网络中越处于核心地位，边粗细代表score大小，这里默认最小score为0.4。节点连线与连接因子数目最多的前30个因子，如图3、图4。节点因子邻接的因子越多，说明该因子在网络中越核心。其中白细胞介素（interleukin－6，IL－6）与周围因子连接最多有58个，血管内皮生长因子A和凋亡信号分子CASP3均有54个，丝裂原激活蛋白激酶8有53个，表皮生长因子受体有52个，说明香附治疗肝癌与这些因子关系密切。

图3 香附－肝癌靶点PPI蛋白互作网络图

图4 香附－肝癌靶点PPI蛋白互作柱状图

2.5 GO功能富集分析图5为GO分析的前20个结果的柱状图，纵坐标代表基因的生物学功能，横坐标代表富集的基因数目；图6为GO分析的前20个结果的气泡图，纵坐标代表基因的生物学功能，横坐标代表富集的基因比例，气泡的大小表示富集的数目。所涉及的生物学功能包括DNA结合转录激活剂活性、特异性RNA聚合酶II、DNA结合转录因子结合、神经递质结合、泛素样蛋白连接酶结合等。香附可能是通过作用影响这些关键生物学功能而发挥治疗肝癌作用的。

图5 GO功能富集分析柱状图

图6 GO功能富集分析气泡图

2.6 KEGG通路富集分析图7为KEGG分析的前20个结果的柱状图，纵坐标代表基因通路，横坐标代表富集的基因数目；图8为KEGG分析的前20个结果的气泡图，纵坐标代表基因通路，横坐标代表富集的基因比例，气泡的大小表示富集的数目。所涉及的生物学通路包括PI3K－Akt信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、MAPK信号通路、甲状腺激素信号通路等，所涉及的生物学过程包括人巨细胞病毒感染、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒感染、乙型肝炎、流体剪切应力与动脉粥样硬化、细胞凋亡等，这些信号通路与生物学过程富集程度较高，说明与香附治疗肝癌的作用关系密切。

图7 KEGG通路富集分析柱状图

图8 KEGG通路富集分析气泡图

图9 为KEGG通路分析得到的肿瘤坏死因子通路，红色表示与香附有效活性成分作用于肝癌相关的因子或分子。

图9 肿瘤坏死因子通路

3 讨论

香附出自《名医别录》，李时珍曰：“《别录》止云莎草，不言用苗用根。后世皆用其根，名香附子”。《本草简要方》“利三焦，解六郁，平怒气，消饮食，通一切气”。《本草备要》称香附“乃血中气药，通行十二经”。尤可看出香附的行气之功。《外科十法》和《医方简义》均记载了香附治疗乳腺癌“敷乳岩，实时消散”“治乳痈乳岩初起者”。肝主疏泄，主藏血，喜调达而恶抑郁，肝郁则气滞，气滞则痰凝血瘀，日久聚而成毒形成为积聚。香附归足厥阴肝经，善于疏肝解郁，尤其适用于肝郁气滞证的疾病。现代医家用香附疏肝解郁的功效配伍其他中药治疗多种恶性 肿瘤（如 肝癌、乳腺 癌）［6－9］及相关 并发症［10－12］（如癌性胸水、抑郁症）。

本研究得到的香附活性成分如异鼠李素、β－谷甾醇、木樨草素和槲皮素等，已经证实这些活性成分具有抗肿瘤的作用。Cai Fangzhen等［13］研究发现，异鼠李素可通过靶向作用于线粒体依赖的内源性凋亡生物学过程、增强间充质上皮转化和抑制基质金属蛋白酶（MMP）2（MMP－2）和MMP－9的过度表达、下调癌细胞p－P13K、p－Akt和p－mTOR蛋白表达来抑制PI3K／Akt／mTOR生物学途径，从而抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞的生长、增殖和转移。严宁等［14］研究发现，β－谷甾醇可降低大鼠血清中丙二醛、超氧化物歧化酶、活性氧等参与氧化应激，降低模型大鼠血清中IL－1β、IL－6和TNF－α的炎性因子水平，通过下调ERK1／2、上调Bcl－2／Bax，参与ERK1／2信号通路（如细胞凋亡和癌变等生物学活动）来抑制心肌缺血再灌注损伤。木樨草素也是重要的抗癌活性成分，董欣敏等［15］研究发现，木樨草素可抑制乳腺癌细胞MDA－MB－231的增殖并诱导其凋亡。Iva Potocnjak等［16］研究发现，木樨草素降低抗凋亡蛋白Bcl－2的表达、增加促凋亡蛋白Bax和caspase－3的表达来促进癌细胞凋亡，增加自噬蛋白Beclin－1、自噬相关蛋白5（Atg5）和微管相关蛋白1A／1B轻链3β－I／II（LC3B－I／II）的表达来促进癌细胞自噬，抑制（Wnt）／β－catenin途径诱导上皮－间质转化过程的逆转。槲皮素能抑制肿瘤细胞的生成和转移，主要调节了以下几种细胞生物学过程和传导途径：细胞周期停滞、细胞凋亡、NF－κB途径、AKT／mTOR信号通路、p38MAPK信号通路和PI3K－AKT信号通路［17－19］等。本研究运用网络药理学分析得到香附通过多成分、多靶点抗肝癌的网络关系，找到了IL－6、血管内皮生长因子A、凋亡信号分子CASP3、丝裂原激活蛋白激酶8和表皮生长因子受体等关键的靶分子。此外，目前对金圣草（黄）素、异黄檀素、玫瑰菌素等物质的抗癌活性还研究较少，通过药物疾病靶点互作网络的构建与分析，得知这些活性成分可能作用于ESR1、AR、PPARG、NCOA2等基因，进而参与核受体活性、配体激活转录因子活性、类固醇激素受体、DNA结合转录因子结合和DNA结合转录激活活性等生物学过程发挥抗肝癌的作用，这些结果可为今后研发新的抗肝癌药物提供新的思路。

本研究通过GO功能富集分析，得到所涉及的生物学功能主要包括DNA结合转录因子结合、DNA结合转录激活活性、RNA聚合酶II特异性、泛素样蛋白连接酶结合、神经递质结合、氧化还原酶活性、与分子氧结合或还原等。表明香附中的活性成分通过参与DNA转录，神经递质结合和氧化反应等过程治疗肝癌。通过KEGG的通路富集分析，主要涉及有PI3K－Akt信号通路、MAPK信号通路、AGERAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路及甲状腺激素信号通路等；主要涉及的生物学过程包括人巨细胞病毒感染、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、MicroRNAs调控、流体剪切应力与动脉粥样硬化、癌症中的蛋白多糖等，这些病毒感染和途径的激活与肝癌关系密切。磷脂酰肌醇－3－激酶（PI3K）／蛋白激酶B（Akt）信号通路是调节机体内细胞生存、生长、分化及凋亡的重要信号通路，其过程是催化相关蛋白的磷酸化发挥促癌作用［20］，如miR－182可通过激活PI3K／AKT信号通路上调其相关蛋白的表达（如MMP－9、c－Myc、VEGF），从而促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移［21］。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）被激活后参与细胞的增殖、分化、凋亡和自噬等过程，因此MAPK信号通路作为经典的途径，在其相关蛋白（细胞外信号调节激酶、c－Jun氮末端激酶以及p38激酶）在磷酸化后可发挥抑癌作用［22］。乙肝病毒所表达的乙肝病毒X蛋白（HBx）可激活NF－κB通路，使转录因子NF－κB活化来调节肝癌细胞的迁移、侵袭［23］；还有研究发现，在乙肝病毒相关的肝细胞肝癌患者的肿瘤样品中观察到miR－200c低表达［24］。研究证实，人巨细胞病毒感染与恶性肿瘤相关［25］，如人巨细胞病毒感染可能通过STAT3信号通路上调内皮细胞特异性分子的表达促进胶质瘤的发展［26］；人巨细胞病毒的US28基因可能激活HIF－1α途径、调节下游迁移及侵袭基因表达从而促进结肠癌细胞的迁移、侵袭［27］。流体剪切应力是通过血液在血管中持续流动，对血管内皮细胞产生剪切力，激活膜感受器和细胞内信号转导（如核因子κB、MAPK、血小板内皮黏附分子等）而调控基因表达，从而影响血管内皮细胞的功能来调节血管张力、血液黏附性、凝血和纤溶间的平衡等［28］，从改变血液循环方面改善肿瘤微环境。

本研究具体展示了肿瘤坏死因子通路分析图（如图8），肿瘤坏死因子与细胞膜上肿瘤坏死因子受体结合，作用于TRADD蛋白（TRAF2／5和R1P1），与衔接蛋白（TAB1／2／3）和转化生长因子激酶1（TAK1）磷酸化MKK4／7和MKK3／6；MKK4／7使JNK1／2蛋白磷酸化作用于激活子蛋白－1（AP－1）参与DNA的转录。TAB1／2／3和TAK1还可以使IKKβ磷酸化，激活核转录因子NF－κB和Tp12，进而磷酸化MEK1，使细胞外调节蛋白激酶（ERK1／2）磷酸化，通过MSK1／2作用于基因转录蛋白CREB参与DNA的转录。DNA转录进一步调控IL－6、Nfkbia基因、Fos等因子的表达，影响肝癌的发生发展。而香附的有效活性成分作用于IKKβ、NF－κB、JNK1／2蛋白和AP－1发挥对肝癌的治疗作用。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法得到香附共16个有效活性成分作用于108个靶点，有105个靶点与肝癌的靶点有交集，构建了香附－活性成分－肝癌－靶点关系可视化网络（成分靶点间共存在333条相互作用关系）和PPI蛋白互作可视化网络（节点105个，边937条），通过GO功能富集和KEGG通路富集分析找到香附治疗肝癌涉及的相关生物学功能和通路并进行注释，提示香附通过多靶点、多通路发挥抗肝癌的作用，证明了在中医学理论的指导下中药抗癌的科学性。