基于网络药理学探讨禾肾丸治疗肾病综合征蛋白尿的作用机制*

张伟宁，周阳扬，胡爽，刘艳杨，何泽云

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410000；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410000

肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是以高蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和不同程度的水肿为主要表现的临床综合征［1］。蛋白尿是NS患者的初始病因，是其进展为慢性肾功能不全的独立危险因素［2］。因此，降低尿蛋白是NS患者治疗的目标之一。

中医学无NS的记载，根据其症状，在疾病的不同阶段可归属为“水肿”“虚劳”“尿浊”等范畴。禾肾丸是何泽云教授根据蛋白尿属脾肾亏虚、精微下泄的基本病机，由清代名方金锁固精丸加减化裁而来，莲子易莲须取其健脾固肾之功，加山药取治虚劳之薯蓣丸意，通补肺脾肾三焦，加大枣顾护中焦胃气，稍佐黄柏泻相火、清湿热，使全方补而不滞。其由沙苑子、山药、牡蛎（醋炙）、龙骨（醋炙）、莲子、芡实、大枣、黄柏组成，是何泽云教授临证30余年治疗各种肾小球性蛋白尿的经验方。前期临床研究证明，禾肾丸可减少24 h尿蛋白量，升高血浆白蛋白，纠正脂代谢紊乱，改善NS患者临床症状［3－6］。此外，动物实验也表明，禾肾丸能减少大鼠24 h尿蛋白排泄，保护受损的足细胞，减轻肾组织纤维化［7－10］。可见，禾肾丸可明显降低蛋白尿，延缓病情，但其作用机制仍未完全清楚。

本研究采用网络药理学方法研究禾肾丸治疗NS蛋白尿的药理机制和分子作用靶点，旨在深入探讨禾肾丸减轻NS蛋白尿的作用机理，为其临床及科研提供更充分的理论依据。

1 材料与方法

1.1 禾肾丸化学成分研究使用中药系统药理学分析平台数据库（TCMSP，http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）［11］和BATMAN－TCM数据库（http：／／bionet.ncpsb.org／batman－tcm／）［12］，分别以“沙苑子（SHA YUAN ZI）”“山药（SHAN YAO）”“牡蛎（MU LI）”“龙骨（LONG GU）”“莲子（LIAN ZI）”“芡实（QIAN SHI）”“大枣（DA ZAO）”和“黄柏（HUANG BAI）”为关键词进行检索，获取其主要化学成分。

1.2 禾肾丸活性化合物筛选及靶点研究口服利用度（oral availability，OB）是药物在体内吸收、分布、代谢和排泄的重要参数之一；类药性（druglikeness，DL）表示与已知化合药相比成分的相似性。中药相关化合物是否具备较高的活性取决于OB值和DL值，值越高，表明中药相关化合物具备更高的活性［13－14］。本研究通过查阅现有相关研究文献，选取OB≥30%、DL≥0.18作为活性化合物的筛选阀值，获取相关活性化合物的靶点蛋白。

1.3 NS和蛋白尿靶点研究通过Genecards（https：／／www.genecards.org／）、TTD（http：／／db.idrblab.net／ttd／）、OMIM（https：／／omim.org／）、Drugbank（https：／／www.drugbank.ca／）、Digsee（http：／／210.107.182.61／geneSearch／）等疾病数据库检索与NS和蛋白尿相关的基因。以“nephrotic syndrome”和“proteinuria”为关键词在上述疾病数据进行检索，下载或导出与NS和蛋白尿有关的全部基因。

1.4 靶点蛋白基因名标准化及禾肾丸治病靶点研究为了便于后续分析及确定靶点蛋白的标准化简写，使用PubMed（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／pubmed）和UniProt（https：／／www.uniprot.org）对禾肾丸活性化合物靶点、NS靶点和蛋白尿靶点进行校正及标准化。通过Venn 2.1（https：／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／）将标准化的禾肾丸活性化合物靶点、NS靶点和蛋白尿靶点进行整合，取交集得到三者共同靶点（简称禾肾丸治病靶点）。

1.5 禾肾丸－活性化合物－治病靶点网络图的构建为了解禾肾丸中单味中药的活性化合物和治病靶点在网络中的重要性，本研究采用Cytoscape 3.2.1软件构建禾肾丸－活性化合物－治病靶点网络图。

1.6 蛋白质相互作用（protein－protein interaction network，PPI）网络图的构建使用STRING数据库（https：／／string－db.org／），设置条件“minimum required interaction score＝0.9”和“hide disconnected nodes in the network”，并运用Cytoscape 3.2.1软件构建禾肾丸治病靶点PPI网络图。探究禾肾丸治疗NS蛋白尿的主要作用靶点。

1.7 GO富集和KEGG通路富集分析为探究禾肾丸治疗NS蛋白尿在生物学角度的科学内涵，本研究将“1.6”中靶点蛋白导入David v 6.8数据库（https：／／david.ncifcrf.gov／），限定物种和背景均为“Homo sapiens”。

2 结果

2.1 禾肾丸候选化合物的筛选通过TCMSP和Batman－TCM数据库收集禾肾丸中药物的化学成分，分别为沙苑子8个、山药12个、牡蛎4个、龙骨2个、莲子4个、芡实1个、大枣18个、黄柏44个，共74个活性化合物。

2.2 禾肾丸活性化合物、NS、蛋白尿靶点和禾肾丸治病靶点预测结果经过PubMed和Uniprot校正所有靶点名称，沙苑子、山药、牡蛎、龙骨、莲子、芡实、大枣和黄柏潜在靶点个数分别为166、59、334、472、35、21、179、92（不包含重复靶点）。应用Genecards、TTD、OMIM（https：／／omim.org／）、Drugbank、Digsee等疾病数据进行检索并整合，分别得到NS和蛋白尿靶点基因分别为1 179个和3 354个。用Venn 2.1软件将禾肾丸活性化学成分靶点与NS作用靶点及蛋白尿作用靶点进行整合，得到禾肾丸治病靶点共112个，见图1。

图1 禾肾丸治病靶点

2.3 禾肾丸－活性化合物－治病靶点网络图构建通过Cytoscape 3.2.1软件构建禾肾丸－活性化合物－治病靶点网络图，该网络由191个节点和538条边组成，其中红色代表单味中药（8个），深蓝色代表活性化合物（74个），蓝色代表治病靶点（112个），见图2。

图2 禾肾丸－活性化合物－治病靶点网络图

2.4 禾肾丸治病靶点PPI网络将112个禾肾丸治病靶点蛋白输入STRING（https：／／string－db.org／）数据库，得出97个靶点蛋白，见图3。根据网络拓扑学指标度值绘制出排名前30位的相关蛋白质节点的条形图，见图4。

图3 禾肾丸治病靶点PPI网络

图4 禾肾丸治病靶点PPI网络关键节点条形图（前30位）

2.5 GO富集与KEGG通路富集分析对PPI网络中的97个靶点蛋白进行GO富集分析，设定P＜0.05。禾肾丸治病靶点在生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）主要富集在药物反应、细胞外空间蛋白质结合等方面。结果表明，禾肾丸治病靶点可能通过上述不同的过程参与了NS的病理和生理过程，见图5。对PPI网络中的97个靶点蛋白进行KEGG通路分析，设定P＜0.05，并去掉无关通路，如锥虫病、乙肝、HTLV－I感染等，见图6。禾肾丸治病靶点主要参与PI3K－Akt信号通路、MAKP信号通路、T细胞受体信号通路等，表明禾肾丸可能介导上述通路发挥治疗NS作用。

图5 禾肾丸治病靶点GO富集结果可视化（BP、CC、MF仅列出前10位）

图6 禾肾丸治病靶点KEGG通路富集分析

3 讨论

中医学认为，NS的发病机制与素体不足，脾肾亏虚，肺卫不固，复感风、湿、疮毒之邪有关。风湿相搏、卫气郁闭、肺失通调、脾气不足、传输统摄不利、肾气虚怯、封藏开阖无权、则水湿泛溢，精微下泄，发为水肿、蛋白尿。何泽云教授认为，蛋白尿属人体的精微物质，为脾气所统摄，肾气所封藏，若脾肾亏虚，则统摄、封藏无力，发为蛋白尿，故蛋白尿形成的核心病机是脾肾亏虚，而健脾益肾固精则是蛋白尿的根本治法。

禾肾丸中沙苑子甘、温，具有补肾助阳、固精缩尿之功，山药甘、平，可通补肺、脾、肾，又兼涩性，二者共为君药；龙骨甘、涩、平，有收敛固涩之功，牡蛎咸、微寒，功同龙骨，二者为常用药对，共具固肾涩精之功；芡实甘、涩、平，偏于补肾，有健脾化湿、固肾涩精之功，莲子甘、涩、平，偏于补脾，亦有健脾止泻、益肾涩精，二者相须为用，共具健脾化湿、补肾涩精之功，其四者共为臣药；黄柏苦、寒，善泻相火、清湿热，为佐药，与君臣药配伍，使其补而不滞，且可防相火、湿热下扰肾精所致精微下泄；大枣甘、温，具有健脾益气养血之功，为使药，脾胃之气充足则受纳运化强健，则统摄精微之力增强。全方以健脾益肾固精为主，祛湿清热为辅，既可固肾精、补脾气，又可泻相火、清湿热、补中有泻、补而不滞，对NS属脾肾亏虚，精微不固，尿蛋白久久不消者疗效显著。

由“禾肾丸－活性化合物－治病靶点网络图”可知，从化合物角度，度值排名前5的化合物分别为quercetin－大枣、沙苑子（槲皮素），aluminum－牡蛎，beta－carotene－大枣、芡实（β－胡萝卜素），beta－sitosterol－大枣、沙苑子（β－谷甾醇），kaempferol－沙苑子（山柰酚）。药理研究表明，槲皮素主要存在于大枣和沙苑子中［15－16］；牡蛎中含有镁、铁、硅、铝等多种人体必需的微量元素［17］；β－胡萝卜素是大枣和芡实的活性成分［18－19］；β－谷甾醇是大枣和沙苑子的已知活性成分［20－21］；山奈酚是沙苑子主要成分［16］，两者结果相符，表明上述化合物可能是禾肾丸发挥治疗NS的主要活性成分。此外，在排名前5的化合物中，沙苑子和大枣对应化合物最多，其次是牡蛎和芡实，该结果与禾肾丸“君臣佐使”大致相符。然而，大枣为使药，该结果可能与不同单味中药所含的成分含量不同有关。

从靶点角度，度值排名前5的分别是PTGS2、PTGS1、ADRB1、LYZ、RXRA。PTGS2、PTGS1与肾脏发生炎症反应有关［22］，PTGS2（即COX－2）在肾脏中主要表达于致密斑。发生炎症反应时，COX－2表达急剧升高。研究表明，COX－2在大鼠及人类肾小球损伤中表达均上调，选择性COX－2抑制剂可减轻肾小球炎症，减轻足细胞损伤及凋亡，减少尿蛋白漏出［23－28］。既往认为，PTGS1（即COX－1）主要维持正常的生理功能。但近年来的研究表明，COX－1与多种炎症反应密切相关［29］，COX－1可能抑制肾小球肾炎大鼠单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）的产生，减轻肾小球内单核细胞浸润，缓解肾小球的炎症［30］。故推测禾肾丸可能通过抑制COX－2及促进COX－1基因或蛋白表达，减少NS患者尿蛋白。

PPI网络结果表明，白细胞介素（interleukin－6，IL－6）、Akt1、JUN等可能是禾肾丸治疗NS的重要靶点群。其中IL－6的度值最大，表明其在禾肾丸治病靶点群中可能占据主要地位。IL－6是一种可介导多种炎症反应的细胞因子，可诱导血管内皮表达黏附分子，导致大量的炎症细胞在肾组织中黏附、聚集。研究表明，血浆高水平的IL－6可促进肾小球血管内皮表面的糖蛋白脱落［31］，导致肾小球毛细血管通透性增强。此外，IL－6可促进肾小球系膜细胞增生和系膜基质的生成，这些因素导致肾小球滤过功能受损，蛋白尿漏出。研究表明，NS患者血清IL－6水平明显升高，且疾病缓解后又明显下降［32－34］。表明禾肾丸可能通过降低IL－6的含量，缓解NS患者肾小球炎症状态，抑制系膜细胞增生，缓解病情，该结果与禾肾丸－活性化合物－治病靶点网络图中PTGS2、PTGS1、ADRB1等炎性靶点处于核心地位的一致，表明禾肾丸在调节NS患者炎症方面发挥重要作用，有待进一步研究。

GO富集分析结果显示，禾肾丸治病靶点在BP、CC、MF主要涉及药物反应、细胞外空间蛋白质结合等方面，表明禾肾丸治病靶点的多系统、多靶点、长期适应性调节是治疗NS可能作用机制。KEGG通路结果表明，禾肾丸治病靶点涉及通路包括：PI3K－Akt信号通路、MAPK信号通路、T细胞受体信号通路等，表明禾肾丸可能通过上述通路发挥治疗作用。PI3K是一种脂类第二信使，与细胞内信号转导有关，其可激活AKT发挥下游生理效应［35］。研究表明，激活PI3K／Akt信号通路是减少肾小球足细胞凋亡、维持足细胞形态和功能完整性的重要途径［36－37］。类似的研究也表明，在慢性肾脏病进程中，激活Akt2有保护足细胞的作用［38］。基于此，推测禾肾丸可能通过激活PI3K－Akt及其下游通路的表达，而发挥对NS治疗的药理学作用。

综上所述，本研究借助网络药理学方法对禾肾丸治疗NS的作用机制进行初步理论探讨，结果表明，禾肾丸的主要潜在活性成分及作用靶基因与NS作用通路相关，为深入研究其作用机制提供了新思路。但由于当前数据库信息有限，且并非实验结果，缺乏实验结果的支持，存在一定的差异性和局限性，但其预测结果可作为今后研究的方向之一，有待进一步的深入实验探讨。