基于实时荧光定量PCR方法分析新生儿先天性巨细胞病毒感染的临床特征

朱娟 李玲 易慧 刘渊 张琪 詹文丽

(广东省妇幼保健院 医学遗传中心，广东 广州 510010)

人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是发生母婴垂直传播疾病的常见原因，在发达国家，新生儿先天性HCMV感染率为0.2%～2.4%[1-3]，我国的新生儿先天性HCMV感染率为0.7%[4，5]。大约10%～15%的HCMV感染胎儿在出生时为有症状感染，临床表现包括胎儿生长受限、低出生体重和中枢神经系统以及多器官受累，导致大约90%的存活婴儿出现神经系统后遗症。10%～15%的无症状先天性CMV感染的婴儿会出现长期后遗症，包括进行性感音神经性听力障碍和智力发育迟缓[6]。在一项为新生儿筛查收集的干血样本研究中，在早产儿和低出生体重儿中先天性HCMV感染的患病率明显增高[7]，而在新生儿重症监护病房住院的婴儿中先天性HCMV感染的患病率也高于总体人口[8，9]。有研究表明，早期诊断和抗病毒药物干预可以改善有症状感染儿童的神经预后，对先天性感染高危新生儿进行检测可以准确诊断和早期治疗。

有研究报道使用实时荧光定量PCR方法可以准确测量尿液中HCMV-DNA copies/ml，并与新生儿症状程度存在一定的相关性，对HCMV先天性感染新生儿是否有后遗症风险是较好的评估指标。当HCMV-DNA拷贝数5×104copies/ml时约70%新生儿会出现神经系统发育异常，当HCMV-DNA拷贝数<3.5×103copies/ml时仅有4%新生儿会出现神经系统发育异常[10]，但与新生儿各系统损伤的关系尚未完全确定。本研究旨在通过对新生儿重症监护病房(neonatal intensive care unit，NICU)住院的婴儿进行尿液HCMV-DNA检测，分析先天性HCMV感染新生儿的临床特征、治疗及转归，并为后续的治疗方案提供思路。

1 资料和方法

1.1 研究对象 回顾性研究2016年1月至2018年12月在广东省妇幼保健院新生儿科收治出生14天内的新生儿，根据新生儿先天性HCMV感染的诊断标准[11]，对其进行尿液HCMV-DNA检测，其中75例新生儿诊断为先天性HCMV感染。排除其他先天性或围产期感染(如单纯疱疹病毒、梅毒)的新生儿。

1.2 研究方法

1.2.1 尿液标本 收集使用无菌尿液收集袋收集尿液后，转移到无菌样本管后，保存在-20℃以备检测。

1.2.2 HCMV-DNA提取及检测 取1ml新生儿尿液严格按试剂盒说明书提取步骤进行DNA的提取后，取2μl严格按照试剂盒说明书采用实时荧光定量法进行PCR扩增反应，每次PCR扩增反应均设置阴性对照进行质控，试剂盒均由中山大学达安基因公司提供。

1.2.3 总结先天性感染HCMV新生儿 HCMV-DNA结果、临床症状、住院天数及疾病转归。

1.2.4 听力筛查 采用耳声发射筛查进行听力筛查，如果听力筛查发现异常，新生儿将接受更精确的听觉脑干反应、听觉稳态反应筛查。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，采用描述性方法对计数资料使用频数和率表示，对于计量资料以均值和标准差表示，两组定性资料间的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 共有75例HCMV-DNA检测阳性新生儿，男婴43例，女婴32例。体重810～3460g，平均体重(1620±96)g，年龄1～14d，平均年龄(8.0±0.4)d，其中20例为足月儿，55例为早产儿(28～36孕周)。

2.2 临床诊断 根据国内外指南对HCMV先天性感染新生儿症状进行分类[12]，75例HCMV先天性感染新生儿常见的临床表现中黄疸占76%(57/75)、肺炎占74.7%(56/75)、贫血占42.6%(32/75)、颅内出血占36%(27/75)。将足月儿及早产儿进行比较，发现贫血及室管膜下囊肿差异具有统计学意义。详见表1。

表1 75例新生儿先天性巨细胞感染的临床特征

2.3 HCMV-DNA检测结果75例感染新生儿尿中HCMV-DNA 平均数值(1.79×105)copies/ml[(5.1×102～2.5×107)copies/ml]，其中56%(42/75)的HCMV-DNA 在(5.0×102～9.9×102)copies/ml之间，18.6%(14/75)的HCMV-DNA在(1.0×103～9.9×103)copies/ml之间，25.3%(19/75)>9.9×103copies/ml，根据结果及时使用更昔洛韦抗病毒治疗。将HCMV-DNA 数值与临床症状进行分析，发现24例贫血新生儿HCMV-DNA[≥(1.0×103)copies/ml]明显高于18例非贫血新生儿[<(1.0×103)copies/ml]，差异具有统计学意义。具体见表2。

表2 75例新生儿HCMV-DNA Copies/ml数值与临床症状相关性分析

2.4 听力测试 通过耳声发射筛查听力，共计13例未通过听力测试，其中3例为单侧听力测试未过，1例为足月儿，12例为早产儿，HCMV-DNA数值高低与听力测试异常没有显著性差异。

2.5 HCMV先天性感染 新生儿预后新生儿平均住院天数39d(3～116)d，其中早产儿平均住院天数(41±5)d，足月儿平均住院天数(25±3)d。1例死亡，17例自动出院，均存在3及3个系统以上的损害。76%(57/75)新生儿痊愈出院。

3 讨论

新生儿巨细胞感染主要由宫内感染(先天性感染)、分娩期产道接触感染、产后母乳喂养感染等途径获得感染[13]，约5%～10%的先天性HCMV感染新生儿有临床症状，临床表现为宫内发育迟缓、肝脾肿大、黄疸、皮疹、血小板减少、紫癜、小头畸形、颅内钙化[6]。有17%～20%将有异常的神经系统损伤，主要是先天性感音神经性耳聋(congenital sensorineural hearing loss，SNHL)、认知延迟、神经运动损伤、智力精神运动发育迟缓、视神经萎缩、患有脉络膜视网膜炎和广泛中央病变的婴儿可能有视觉障碍[14，15]。在本研究中，75例HCMV先天性感染新生儿常见的临床表现中黄疸占76%(57/75)、肺炎占74.7%(56/75)、贫血占42.6%(32/75)、颅内出血占36%(27/75)，本研究将足月儿及早产儿进行比较，发现贫血及室管膜下囊肿差异具有统计学意义，这与HCMV先天性感染报道症状相似。由于HCMV感染临床表现为常为多系统损害，可能为HCMV感染可导致促炎性变化，对胎盘发育和功能、病毒传播和胎儿存活率有重要影响[16，17]。

对疑似HCMV感染新生儿进行HCMV筛查是有必要的，通过实时定量PCR方法对尿液中的CMV-DNA进行普遍筛查及早期检测，可识别有听力损失和认知延迟风险的婴儿,通过早期使用抗病毒药物干预可能会改善症状性感染的神经系统损害及预后[18，19]。在本研究中，共计17.3%(13/75)未通过听力测试，1例为足月儿，12例为早产儿，尿HCMV-DNA平均数值为平均数值(1.79×105)copies/ml[(5.1×102～2.5×107)copies/ml]，数值高低与听力测试异常没有显著性差异。Yamaguchi[10]在60例HCMV感染的新生儿中，发现尿HCMV- DNA最高者的拷贝数是最低者的(4.6×105)倍，HCMV感染和感音神经性耳聋(sensorineural hearing loss，SNHL)的新生儿尿HCMV-DNA copies/ml明显高于HCMV感染但没有SNHL的新生儿，由于HCMV感染而导致的SNHL表现为一种晚期听觉功能障碍，建议对于HCMV感染特别是拷贝数高的婴儿，需要仔细监测晚发性SNHL的发展并进行听力随访[10，20]。本研究将HCMV-DNA拷贝数与临床症状进行分析，发现24例贫血新生儿HCMV-DNA[≥(1.0×103)copies/ml]明显高于18例非贫血新生儿[<(1.0×103)copies/ml]，差异具有统计学意义，这可能与HCMV损害血液系统有关，但与神经系统、呼吸系统、眼部系统差异无统计学意义。有学者报道高HCMV- DNA血症可预测无症状HCMV感染新生儿感染后遗症[21]，尿HCMV- DNA拷贝数高也可预测晚期神经系统损害[10]，建议尿HCMV-DNA拷贝数高的新生儿应进行MRI随访以便及时监测到神经系统异常。

HCMV感染新生儿的预后与其临床症状及多系统损害情况相关。在本研究中，1例足月新生儿死亡，17例自动出院，均存在3及3个系统以上的损害，76%(57/75)新生儿痊愈出院。有研究报道HCMV感染新生儿期有神经系统损害的婴儿的预后比肝大、脾大或紫癜的预后差，分别有73%和30%的婴儿有严重的永久性后遗症[22]。虽然先天性HCMV感染的新生儿表现在类型和频率上与有症状的婴儿相似，但总体预后较好。

综上所述，新生儿先天性HCMV感染时的主要临床表现为黄疸、肺炎、贫血、肺炎及颅内出血，通过检测尿HCMV-DNA可为早期使用抗病毒药物干预提供诊疗依据，HCMV感染新生儿的预后与及多系统损害有关。