蛇床子素在牧草和土壤中残留研究

于红妍，侯秀敏，唐炳明

(青海省草原总站，青海 西宁 810008)

蛇床子素(Osthole)是从蛇床(Cnidiummonnieri)、欧前胡(Peucedanumostruthium)等传统中草药中提取的香豆素类化合物，对多种鳞翅目害虫、同翅目害虫均有良好的防治效果，具有高效、低毒和低残留等特点，为我国首创的新型高效环保生物农药[1]。目前，对蛇床子素的测定研究多集中在中药常规质量控制、天然提取物及生物试样等方面[2～5]，围绕青藏高原高寒牧区蛇床子素在防控草原虫害后牧草和土壤中残留分析的研究尚未见报道。因此，有必要对防控虫害后的牧草和土壤中蛇床子素的农药残留量进行快速、准确地测定，为其科学合理使用提供依据，以便达到生物防控安全有效的目的。本研究利用液质联用技术对高寒牧区防控虫害后牧草及土壤中蛇床子素残留量进行了快速分析，以期为高寒牧区防控草原虫害药剂的筛选提供科学依据。为了了解它的行为环境，本文对其残留进行了研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 Agilent 1260 Imifity ll -Agilent64700三重四极杆液质联用仪，电喷雾ESI，色谱柱Zorbax SB-C18，Narrow Bore RR100×2.1 mm，3.5 μm。梅特勒-托利多MS205DU精密电子天平。

1.1.2 测试样品 2020年8月20日土壤和牧草样品采集于青海省海北州祁连县央隆乡，直升飞机施药防控草原蝗虫区域，采用“Z”字形取样法采集土壤和牧草样品，取土深度0～10 cm，4分法采集500 g放于自封袋中并写明标签，采集牧草样品，-20 ℃条件下保存待测。

蛇床子素标准储备溶液：0.025 mL，用乙腈-水(3+2)10 mL。

蛇床子素标准品(纯度为98%以上，批号：110822-201710)，甲醇、丙酮为色谱纯，二氯甲烷、正己烷为分析纯，试验用水为去离子水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件 Zorbax SB-C18色谱柱(100×2.1mm，i.d. 3.5μm)；柱温30 ℃；液相流速0.2 mL/min；进样量1 μL；流动相：水(含0.1%甲酸)—乙腈(含0.1%甲酸)：0min，10%乙腈；3～6 min，70%乙腈；9～14 min，95%乙腈；14.01～20 min，10%乙腈。

1.2.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI+)，正离子模式，雾化气为氮气，雾化气压力20 psi，离子喷雾电压4 000 V，干燥气温度325 ℃ ，干燥气流量10 L/min，鞘气温度400 ℃ ，鞘气流速11 L/min，检测方式：MRM。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备 称取粉碎的草样5 g于80 mL离心管中，加入甲醇40 mL乙腈，用匀浆机15 000 r/min，匀浆2 min，加入5 g氯化钠，再匀浆提取1 mL在4000 r/min，离心5 min，取上清液20 mL，在40 ℃水浴中旋转浓缩至约1 mL，待净化。在Spe-Pak Vac柱中加入约2 cm无水硫酸钠，加样前用4 mL乙腈+甲苯(3+1)预洗柱，当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将样品浓缩液转移至净化柱上，并更换新接收瓶接收，再每次用2 mL乙腈+甲苯(3+1)洗涤样液瓶3次，并将洗涤液移入柱中，用25 mL乙腈+甲苯(3+1)洗涤农药及相关化学品，合并于接收瓶中，并在40 ℃水浴中旋转浓缩至约0.5 mL，氮吹仪上吹干，迅速加入5 mL乙腈+水(3+2)，混匀，过0.22 μm滤膜过滤后，待测。

1.3.2 高分辨质谱定性与紫外峰面积外标法定量 采用液相色谱保留时间与高分辨质谱进行定性，在选定的色谱条件下，蛇床子素的保留时间为9.88 min，以分子离子峰与碎片峰进行结构确证。采用紫外峰面积外标法进行定量，然后进行RRLC分析。

2 结果与讨论

2.1 结果分析

由图1a，图1b可知，空白的响应值很低，对样品检测没有影响。根据图2a，图2b选择189.1为定量离子峰，由图3a-图5b可见，对三个样品的测定均未检出蛇床子素。通过对比图2b和图6b发现加标回收率较低，以处理好的样品为溶剂配制标准品得到基质标，由图7，图8发现样品的基质效应很强，这也是加标回收率较低的原因。

图1a 空白多反应监测总离子流图

图1b 空白质谱图

图2a 标准品多反应监测总离子流图

图2b 标准品质谱图

图3a 样1多反应监测总离子流图

图3b 样1质谱图

图4a 样2多反应监测总离子流图

图4b 样2质谱图

图5a 样3多反应监测扫描图

图5b 样3多反应监测总离子流图

图6a 样品加标多反应监测总离子流图

图6b 样品加标质谱图

图7 基质标多反应监测总离子流图

图8 基质标质谱图

2.2 标准曲线

参照文献[6]中的方法，进行方法的线性及灵敏度评价，将0.025 mg/mL的蛇床子素标准储备溶液用乙腈+水(3+2)稀释成质量浓度分别为1.00，10.00，100.00 ng/mL的标准溶液。以蛇床子素的质量浓度为横坐标，对应的峰面积响应值为纵坐标绘制标准曲线。结果表明：蛇床子素的质量浓度在0.01～0.50 ng/mL与相对应的色谱峰面积呈现良好的线性关系，线性回归方程为：y=5 215.7395x+0.00E，线性相关系数为0.9997。详见图9。

图9 蛇床子素标准曲线

2.3 回收率测定结果

结果表明：土样中回收率为97.34%～97.40%，精密度为8.31%，在牧草中的回收率为85.34%，回收率、精密度符合检测要求，具体数据见表1。

表1 蛇床子素在牧草和土壤中加标回收率测定结果

2.4 方法的最小检出量和最低检测质量分数

仪器对蛇床子素标准品最小检出量为5 ng，方法对土壤中蛇床子素残留最低检测质量分数均为0.2 μg/kg，牧草样未检出。详见表2。

表2 蛇床子素在牧草和土壤中残留测定结果

3 讨论

本研究首次建立了一种测定牧草和土壤中蛇床子素残留的液质联用分析方法。该方法对土壤中蛇床子素的最小检出量为5 ng，蛇床子素在土壤中的平均回收率为97.34%～97.40%；在牧草中的回收率85.34%，所建立的方法灵敏度、准确度、精密度和重现性等方面均能满足农药残留分析的要求，实现本研究预期目标，为高寒牧区草原虫害的安全、有效防控提供了可靠、准确的分析方法和科学依据。