甘蓝型油菜隐性核三系临保系遗传多样性分析

陈 雪，王 瑞，张胜森，郭青青，李加纳

西南大学 农学与生物科技学院，重庆 400715

甘蓝型油菜是我国重要的油菜作物[1]，存在明显的杂种优势.杂种优势利用的途径包括化学杀雄[2]、波里马不育[3]、萝卜质不育[4]、显性核不育[5]、自交不亲和性[6]、细胞质+细胞核双重不育[7-8]和隐性核不育[9-10]等，隐性核不育因其恢复源广泛且配组自由成为杂种优势利用的主要途径.但隐性核不育存在需与临保系搭配使用这一问题，让其利用受到很大限制.

遗传多样性分析是种质资源评价和杂种优势利用的基础.随着高通量测序技术和功能基因组学的发展，SNP芯片为作物种质资源的遗传多样性分析提供了新的技术手段，目前已有甘蓝型油菜SNP芯片应用于聚类分析和基因定位研究[11-12].本文以西南大学油菜生物学团队选育出的39份甘蓝型油菜隐性核三系临保系为材料，通过武汉双绿源创芯科技研究院有限公司提供的油菜50K SNP芯片分析评价其遗传多样性，为临保系配制隐性核不育提供准确的遗传背景指导.

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料39份，为西南大学油菜生物学选育的甘蓝型油菜隐性核三系临保系.

1.2 方 法

1.2.1 播种与取样

2018年10月初将材料播种于重庆市北碚区西南大学歇马油菜基地试验田，于苗期摘取每份临保系材料生长大小一致的3个单株的幼嫩叶置于2 mL离心管中，-20 ℃冰箱保存.

1.2.2 DNA提取

用CTAB法[13]提取DNA，用1.0%琼脂糖电泳检查DNA的质量，用Nanodrop核酸蛋白质分析仪检测DNA的浓度，并将DNA浓度稀释成50 ng/L，-20 ℃保存备用.

1.2.3 SNP芯片分析

使用油菜50K高通量芯片对39份临保系的每份材料进行DNA光学扫描，通过光学设备扫描“红”或“绿”和“有”或“无”来区分一个SNP位点.此SNP芯片检测通量大，几十个位点可以通过1次检测完成，并且具有高达99.9%以上的检测准确性.

1.2.4 数据统计与分析

在R3.5.0环境下使用CMplot包(https：//github.com/YinLiLin/R-CMplot)对临保系所有SNP位点统计各染色体SNP密度；基于neighbor-joining算法使用MEGA5[14]软件对39个临保系SNP标记数据进行聚类分析；Lee等[15]在2014年开发出SNPhylo流程(http：//chibba.pgml.uga.edu/snphylo/)，BASH命令行一步执行生成遗传进化树.39个临保系SNP标记数据文件通过选择参数提取具有代表性的SNP位点，MUSCLE多重比较，DANML制作最大似然树得到进化树图像.

2 结果与分析

2.1 表型观察与统计

39份甘蓝型油菜临保系在品质、角果长度、种子颜色、花瓣颜色、抗倒、株型和生育期等方面不尽一致，其简易表型观察如表1.RW01-RW21品质为低芥酸低硫苷，花瓣颜色为典型黄色.RW22-RW39材料中，RW22为低芥酸高硫苷，RW37为高芥酸高硫苷，其余品质都为高芥酸低硫苷，而花瓣色泽为白花、粉白色、粉桃色、桃红色不等.这些临保系的隐性上位基因和隐性不育基因处于隐性纯合状态，其他遗传背景通过各种育种手段和技术发生了重组和交换.

表1 39份甘蓝型油菜隐性核三系临保系简易表型观察

2.2 SNP密度分布

利用武汉双绿源创芯科技研究院有限公司的油菜50K SNP芯片对39份临保系材料进行基因型鉴定，共鉴定出25 401个高质量的SNP标记，使用CMplot R包绘制19条染色体SNP密度分布图(图1).结果显示，SNP标记并非在染色体上均匀分布，染色体Chr11和Chr14出现SNP标记数大于113个/Mb，而几乎每条染色体都存在SNP标记空缺的现象.

图1 SNP密度分布图

2.3 MEGA5分析39份临保系遗传多样性

利用生物学软件MEGA5和SNP标记数据文件，基于neighbor-joining算法对39份临保系进行聚类分析(图2).在0.3阈值下，39份材料可聚成A，B，C，D 4个大类，A类群只包括RW22，为黑籽粉花临保系；B类群体包括19份材料，除RW03，RW13两个角果极短的黄籽黄花材料外，其余为高芥酸、非黄花临保系；C类群体包括10份材料，为低芥酸低硫苷、黄籽黄花临保系；D类群体包括9份材料，为低芥酸、抗倒伏黄花临保系.因此，聚类分析可用于区别花色和品质性状，也可应用于甘蓝型油菜临保系遗传背景和性状之间的比较和评价.

图2 39份甘蓝型油菜临保系聚类图

2.4 SNPhylo分析39份临保系遗传多样性

利用生物学软件SNPhylo分析SNP位点数据，构建39份临保系材料的遗传进化树(图3).进化树显示出5个主干分支，RW03，RW13和RW22分布在中心节点附近.低芥酸低硫苷和黄花临保系分布在两个主干分支上，一个分支上有RW01，RW15，RW20，RW14，RW18，RW19，RW17等，另一个主干分支上有RW02，RW07，RW10，RW06等.同一主干分支的临保系遗传背景最为接近，其分布距离反映出临保系之间的遗传距离.而高芥酸非黄花临保系分布在另外2个分支上.RW28，RW23，RW35，RW26，RW27，R38，RW25在同一分支上分散.RW31，RW24，RW30和RW32，RW37以及RW34，RW39，RW36分别处于同一个主干分支下的3个次生分支上.此外，还有一主干分支上分布着RW29和RW33.遗传进化树可区分品质性状和花瓣颜色性状，但对种子颜色、抗倒等其他性状不能区分.与聚类分析结果一致，但遗传进化树与聚类图相比较更为形象直观，材料的遗传亲缘关系反映尤为充分.

图3 39个甘蓝型油菜临保系遗传进化树

3 讨论和结论

利用SSR，AFLP，SNP，SCAR等各种标记方法，甘蓝型油菜遗传多样性分析已在黄籽油菜[16]、隐性核不育[17]、杂交亲本评价、油菜区试指纹图谱[18]等方面做了很多研究工作.甘蓝型油菜隐性核三系临保系在选育策略[19-20]、分子标记[21-22]、专利和应用[23]等方面也取得了多项成果，但利用SNP芯片分析甘蓝型油菜隐性核三系临保系遗传多样性还未有文献报道.本研究利用50K油菜芯片SNP对39份甘蓝型油菜临保系材料进行遗传分析，结果表明临保系材料间具有较好的遗传多样性.根据SNP数据绘制染色体SNP密度分布图，SNP标记基本覆盖了整个染色体组，但并非均匀分布，甚至每条染色体都出现SNP标记空缺现象，表明武汉双绿源创芯科技研究院有限公司开发的油菜50K SNP芯片设计不够完善，也说明临保系材料数量太少，遗传变异类型不够丰富.

对39份临保系材料的聚类结果表明，表型为粉白色、抗倒伏、株型性状优异的临保系材料RW32和RW37优先聚集到一起；表型为粉桃色、叶片大、花期晚的临保系材料RW34，RW36也优先聚集到一起，这充分说明SNP芯片揭示的遗传多样性和性状基本一致，可以充分反映材料之间的遗传差异.在该研究中，临保系RW22单独聚为一类，与其他材料具有明显的遗传特异性，而在表型上该材料确实具有黑籽、粉花等非常特殊的农艺性状，需要对该特异种质资源加以保存和利用.由此可见，SNP聚类结果能较好地反映材料间的亲缘关系，可为种质资源的利用提供参考.