太子参NF-Y基因家族鉴定及表达分析

李 军，周 涛，王崇敏，刘晓清

贵州中医药大学 中药民族药资源研究院，贵阳 550025

核因子Y(nuclear factor Y，NF-Y)，又称CBF或亚铁血红素激活蛋白HAP，主要由NF-YA，NF-YB及NF-YC 3个亚家族组成[1].NF-Y蛋白家族的不同成员可通过不同途径进入细胞核，其中NF-YA是由Importin β介导输入核中，而含有HFM亚基的NF-YB和NF-YC作为异二聚体复合物则由Importin 13介导进入细胞核[2].3个亚家族可以单独调控基因表达，也可形成NF-YB/NF-YC CONSTANS或NF-Y复合体，进一步结合CCAAT元件参与基因表达的调控[3].

在哺乳动物及酵母体内，NF-Y的3个亚基均由单基因编码[4]，但植物中每个亚基均由基因家族编码[5]，提供了更多的 NF-YA/NF-YB/NF-YC 三聚体组合，增加了核因子Y功能的复杂性，参与了在种子萌发、胚胎发育、开花过程以及植物对氮、磷、脱落酸(ABA)以及盐分胁迫等的响应过程[6].研究表明大豆GmNF-YCa在蔗糖和甘露醇诱导后上调表达，过表达可显著改善甘露醇和蔗糖胁迫下拟南芥种子的发芽率、根长和侧根伸长明显等[7].谷子SiNF-YA6主要在根部表达，同时受低氮、干旱、高盐和 ABA 等胁迫的诱导表达，该基因的过表达显著提高了拟南芥对低氮胁迫的耐受性[8].由此可见，NF-Y蛋白家族的不同成员不仅参与了植物多种生长发育进程，且在植物抵御逆境胁迫等方面具有重要作用.

太子参为传统中药，系石竹科植物孩儿参Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Paxex Pax et Hoffm的干燥块根，含有多糖类、皂苷类、磷脂类、环肽类等活性成分，具有增强免疫力、降血糖、抗疲劳等多种功效[9].随着近年来太子参需求量的逐年上升，逐步转向人工种植，主要分布于温暖湿润的气候环境中[10].高温、干旱等逆境容易引起太子参生长发育受阻，从而导致减产、病害等问题.因此，研究NF-Y基因家族的表达模式及对干旱胁迫的响应，对于深入理解其在太子参生长发育过程中的功能和作用，解析NF-Y蛋白在植物抵抗逆境胁迫中的作用机制具有重要意义.

1 材 料

供试材料为贵州施秉常用种，转录组数据由上海美吉生物医药科技有限公司测序完成.数据库1：采用课题组前期构建的太子参转录组数据库(叶、茎、根表皮、根木质部)[11]；数据库2：参照路丙社等[12]的方法，设置30%，44%，58%，72%，86%及100%的土壤水分梯度，相对含水量=土壤含水量/田间持水量×100%，取块根进行转录组测序，de Novo组装；数据库3：采用0.2 mg/L NAA(萘乙酸)诱导组培苗生根[13]，然后转入MS+45 g/L蔗糖，MS+60 g/L蔗糖及MS+75 g/L蔗糖的培养基中培养，取块根进行转录组测序，de Novo组装.

2 方 法

2.1 NF-Y基因家族的鉴定

从NCBI中下载甜菜(BetavulgarisL.)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)等的NF-Y蛋白家族成员.通过BlastP分别比对3个数据库，从中鉴定太子参NF-Y家族同源序列，期望值设为小于0.001，结合数据库原有的注释结果，剔除注释错误的序列，将3个数据库中鉴定的NF-Y蛋白序列统一编号.

2.2 系统进化树的构建及蛋白保守序列比对

采用muscle 3.8软件(http：//www.drive5.com/muscle/)对太子参及甜菜、拟南芥及水稻进行多序列比对，分析结果用MEGA X(https：//www.megasoftware.net/)分析，采用邻接法(neighbor-joining method)构建NF-Y的系统进化树，检验参数Booistrap重复1 000次.利用MEME在线程序(http：//meme-suite.org/)对NF-Y蛋白家族的保守基序进行分析，预测太子参NF-Y蛋白家族的蛋白质保守基序(Motif)，参数设置为默认值，并用WebLogo软件(http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)展示保守基序.

2.3 表达分析

采用RSEM软件(http：//deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)进行基因表达分析，采用RPKM值(reads per kb permillion reads)表示基因的相对表达水平，采用Cluster 3.0软件对NF-Y基因的表达水平进行标准化，最后采用Heatmap图展示基因的表达.

2.4 蛋白互作分析

采用美吉生物云平台(https：//cloud.majorbio.com/)中的STRING数据库(http：//string-db.org/)对NF-Y蛋白互作进行分析.参考拟南芥的蛋白互作关系，构建太子参NF-Y蛋白的互作关系网络.采用confidence score值评价互作关系的可信度，默认值0.4，值越大代表互作关系越可靠.

3 结 果

3.1 太子参NF-Y家族基因的鉴定与生物信息学分析

采用拟南芥、水稻等模式植物的NF-Y蛋白检索3个太子参转录组数据库，结合注释信息及手工分析，共鉴定出24个NF-Y基因(表1)，分别归入3个亚家族，包括9个NF-YA，10个NF-YB及5个NF-YC.其中数据库1中获得9个NF-YA，6个NF-YB及4个NF-YC；数据库2中获得8个NF-YA，8个NF-YB及4个NF-YC；数据库3中获得8个NF-YA，7个NF-YB及4个NF-YC.PhNF-YA8仅在数据库1中检索到，PhNF-YB5，PhNF-YB6，PhNF-YB7，PhNF-YB9及PhNF-YC5未在数据库1中检索到，暗示这些基因可能是诱导型基因.

表1 太子参NF-Y基因家族的筛选与鉴定

3.2 太子参NF-Y家族基因蛋白的保守基序及进化分析

为了推测24个太子参NF-Y蛋白的功能，分别构建了NF-YA，NF-YB及NF-YC氨基酸序列的系统进化树(图1).太子参的9个NF-YA蛋白分别归入3个类群，其中PhNF-YA2，PhNF-YA3，PhNF-YA7，PhNF-YA9与AtNF-YA3，AtNF-YA5，AtNF-YA6，AtNF-YA8归为第1类群，PhNF-YA1，PhNF-YA4，PhNF-YA5，PhNF-YA8与AtNF-YA1，AtNF-YA9归为第2类群，PhNF-YA6与AtNF-YA2，AtNF-YA10归入第3类群.

图中分支点的数字表示基于1 000次重复该节点的自展支持率；标尺代表遗传距离.

太子参的10个NF-YB蛋白分别归入4个类群，其中PhNF-YB2，PhNF-YB3，PhNF-YB10与AtNF-YB1，AtNF-YB2等6个拟南芥NF-YB蛋白归入第1类群，PhNF-YB1，PhNF-YB4，PhNF-YB5与AtNF-YB4，AtNF-YB5归入第2类群，PhNF-YB6及PhNF-YB9归入第3类群，PhNF-YB7，PhNF-YB8与AtNF-YB6，AtNF-YB9归入第4类群.太子参的5个PhNF-YC蛋白归入同一个类群.

为了解太子参NF-Y蛋白的序列特点，分析了太子参NF-Y蛋白的保守基序(图2)，发现PhNF-YA，PhNF-YB及PhNF-YC亚家族中均具有一段高度保守的序列，暗示这些序列与太子参NF-Y蛋白的功能密切相关.

图2 太子参NF-Y蛋白的保守基序

3.3 不同组织中NF-Y家族基因的表达分析

为了进一步阐明太子参NF-Y蛋白的功能，分析了这些基因在叶、茎、块根皮部及块根木质部中的表达模式(图3a)，结果显示9个PhNF-YA基因中PhNF-YA4，PhNF-YA5，PhNF-YA7，PhNF-YA9仅在叶中有较高表达，PhNF-YA2，PhNF-YA6在叶及茎中均有较高表达，PhNF-YA1在块根木质部有较高表达，PhNF-YA3在块根皮部有较高表达.6个PhNF-YB基因中PhNF-YB1和PhNF-YB4在块根皮部及茎中有较高表达，PhNF-YB10仅在叶中有较高表达，PhNF-YB3在块根木质部中有较高表达，PhNF-YB8在块根木质部及叶中有较高表达.4个PhNF-YC基因中PhNF-YC2在叶中有较高表达，其余基因表达量较低.19个基因的蛋白互作关系分析结果显示(图3b)，PhNF-YA4及PhNF-YC2等9个PhNF-Y蛋白的互作关系在太子参叶片的生长发育过程中具有重要作用.

图3 太子参NF-Y基因家族在不同组织中的表达及蛋白互作

3.4 块根中NF-Y家族基因对土壤水分胁迫的响应

为了研究太子参NF-Y蛋白对水分胁迫的响应机制，分析了不同土壤水分胁迫下块根中NF-Y基因的表达模式(图4a)，结果显示8个PhNF-YA基因中PhNF-YA1，PhNF-YA4，PhNF-YA5，PhNF-YA7，PhNF-YA9在干旱胁迫下(30%)有较高表达，PhNF-YA1，PhNF-YA2，PhNF-YA3在低度干旱条件下(58%)有较高表达，PhNF-YA6随着土壤水分含量的上升表现出上调的趋势.10个PhNF-YB基因中PhNF-YB2，PhNF-YB3及PhNF-YB8在干旱胁迫下(30%)有较高表达，PhNF-YB10在适度干旱胁迫下(44%)有较高表达，PhNF-YB1在低度干旱条件下(58%)有较高表达.5个PhNF-YC基因中PhNF-YC1，PhNF-YC3，PhNF-YC4在干旱胁迫下(30%)有较高表达，PhNF-YC2与土壤水分的增加趋势基本一致，PhNF-YC5仅在涝滞环境下(100%)有较高表达.23个PhNF-Y蛋白的互作关系表明(图4b)，PhNF-YA1，PhNF-YB4，PhNF-YC3及PhNF-YC4等11个PhNF-Y蛋白积极响应土壤水分的胁迫，调控植物的生长发育.

图4 太子参块根中NF-Y基因家族在土壤水分胁迫下的表达及蛋白互作

3.5 根中NF-Y家族基因对蔗糖胁迫的响应

为了研究太子参NF-Y蛋白对蔗糖诱导的响应机制，利用组培苗观察不同蔗糖浓度培养条件下太子参根部NF-Y蛋白的表达模式(图5a)，结果显示，随着培养基中蔗糖浓度的升高，3个PhNF-YA基因的表达呈现逐渐升高的趋势，7个PhNF-YB基因中PhNF-YB5的表达量随蔗糖浓度的升高而升高，PhNF-YB1，PhNF-YB2的表达呈先上升后下降的趋势，PhNF-YB3，PhNF-YB4，PhNF-YB8，PhNF-YB10的表达呈先下降后上升的趋势.4个PhNF-YC基因中PhNF-YC3及PhNF-YC4基因的表达受高浓度蔗糖诱导，PhNF-YC1在高浓度蔗糖条件下表达受到抑制.19个PhNF-Y蛋白的互作关系表明(图5b)，PhNF-YA1，PhNF-YB4，PhNF-YC2等10个PhNF-Y蛋白积极响应蔗糖胁迫，协同调控植物的生长发育.

图5 太子参根中NF-Y基因家族在蔗糖诱导下的表达及蛋白互作

4 讨 论

已有证据表明NF-Y蛋白在叶绿体形成及光合作用中具有重要作用.拟南芥AtNF-YA5，AtNF-YB9和AtNF-YC9形成的复合体可与GCR1，GPA1和Pirin1组成信号传递链，参与调控植株中叶绿素a/b结合蛋白基因的表达[14].过量表达小麦TaNF-YB3后显著提高叶绿素含量、光合速率及早期生长率[15].水稻Os-NF-YB2/3/4可影响多个核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧合酶小亚基和叶绿素a/b结合蛋白基因的表达[16].本研究发现太子参PhNF-YA4，PhNF-YA5等6个基因，PhNF-YB8，PhNF-YB10及PhNF-YC2在叶中高量表达，且可能具有复杂的相互作用关系，暗示这些基因在协同调控叶的生长发育及光合作用中具有重要作用，但具体机制尚不明确.拟南芥NF-YA1/5/6/9共同调控雄配子发育、胚胎发育、种子形态及萌发等[17-18]，单个基因或两个基因的突变并不能发生表型的改变，但过表达其中任一基因均能影响种子的发育，暗示了太子参PhNF-YA亚家族也有功能冗余的可能性.此外，PhNF-YA1及PhNF-YB3，PhNF-YB8在块根木质部中有较高表达，且进化分析结果显示PhNF-YA1，PhNF-YA4，PhNF-YA5，PhNF-YA8与AtNF-YA1，AtNF-YA9聚为一类，暗示了这些太子参NF-Y基因可能与太子参块根的发育有一定关系.

NF-Y蛋白在水分胁迫过程中具有重要作用.研究表明拟南芥大部分NF-YA基因呈上调表达，而小麦中NF-YA则相反[19-20].过表达AtNF-YB1和ZmNF-YB2可显著减少转基因植株的叶片水分流失及提高抗旱能力[21].部分NF-Y基因的转录受ABA途径调控，转录后受到miR169的调控[22].本研究中太子参PhNF-YA1，PhNF-YA4，PhNF-YA5，PhNF-YA7，PhNF-YA9，PhNF-YB2，PhNF-YB3，PhNF-YB8及PhNF-YC1，PhNF-YC3，PhNF-YC4在干旱胁迫下均显著上调，且进化分析结果显示PhNF-YB2，PhNF-YB3，PhNF-YB10与AtNF-YB1，AtNF-YB2等6个拟南芥NF-YB蛋白归入一类，暗示了这些太子参NF-YB蛋白与抗旱有密切联系.此外，蛋白间互作关系暗示PhNF-YC3，PhNF-YC4在干旱胁迫响应过程中可能具有核心调控作用.值得注意的是，PhNF-YA6及PhNF-YC2的表达随土壤水分的增加而增加，揭示了这些基因在太子参感知土壤水分变化的过程中具有重要作用.

蔗糖及其衍生物不仅是光合同化物与能量的运输和贮藏形式，也是植物中一种重要的信号分子，调控基因表达及影响器官的生长发育[23-24].本研究分析了太子参NF-Y蛋白对蔗糖胁迫的响应，发现了大部分基因能够响应蔗糖浓度的变化，暗示了环境因子可通过影响组织中蔗糖的分布来调控NF-Y蛋白的表达，进而影响器官的形态建成.